INVESTIGADORES
SARNACKI Sebastian Hernan
congresos y reuniones científicas
Título:
Efecto beneficioso del consumo de Lactobacillus casei sobre la enterocolitis causada por Salmonella enterica
Autor/es:
NOTO LLANA, MARIÁNGELES; GARAVELLO, GIANINA; SARNACKI SEBASTIÁN; AYA CASTAÑEDA M DEL R; GIACOMODONATO MN; CERQUETTI MC
Lugar:
C.A.B.A.
Reunión:
Congreso; 15° Congreso internacional de medicina interna del Hospital de Clínicas "José de San Martín; 2014
Institución organizadora:
Hospital de Clínicas "José de San Martín"
Resumen:
Objetivo:
Analizar el efecto del consumo L. casei en el desarrollo de la
enterocolitis por Salmonella utilizando un modelo murino de infección.
M&M:
Bacteria: Se utilizó la cepa salvaje de Salmonella enterica serovariedad
Enteritidis #5694 (S. Enteritidis) para infectar a los ratones. La
bacteria fue cultivada en TSB (trypticase soy broth) a 37ºC, con
200 revoluciones por minuto, luego se centrifugó y fue resuspendida a la
densidad apropiada en solución salina. En todos los casos el número de bacteria
fue determinado por plaqueo en diluciones correspondientes en trypticase soy
agar.
Animales: En todos los
experimentos se utilizaron ratones BALB/c de 6 a 8 semanas
de vida.
Salmonella infection
and generation of enterocolitis: los animales fueron pretratados vía oral con 20 mg
de estreptomicina (Sigma Aldrich). Veinticuatro horas después los ratones se inocularon vía intragástrica (ig) con 1000 unidades
formadoras de colonias (UFC) de la cepa salvaje colocando una sonda PC-50. A
diferentes tiempos se tomaron muestras del intestino para estudios histológicos
y para estudios de PCR a tiempo real.
Administración del probiótico: leche fermentada con Lactobacillus casei
DN-114001 de uso comercial
(Danone S.A.) fue utilizada durante este estudio. La misma fue administrada de
manera ad libitum, como descripto anteriormente (3) durante 7 días consecutivos
anteriores a la infección por S. Enteritidis. Los ratones ingirieron en
promedio la dosis de 1 x 108 UFC de L. casei por día.
Grupos experimentales: 1: EC: recibieron estreptomicina y Salmonella;
2: L. casei + EC: recibieron Lactobacillus casei, estreptomicina
y Salmonella; 3: Control: animales sin tratar; y 4: L. casei + Strep: ratones que
recibieron únicamente el probiótico y estreptomicina.
Colonización bacteriana y persistencia: A los tiempos indicados post infección,
los ratones fueron sacrificados y las cargas bacterianas analizadas. Todas las
placas de Peyer localizadas en el intestino grueso (6 a 8) y un
tercio del bazo fueron removidas asépticamente de cada animal y homogeneizadas
en solución salina estéril. Las colonias similares a Salmonella se plaquearon
en agar SS y luego en agar TSI (triple-sugar-iron) y testeadas para el antígeno
somático O9.
Estudios
histológicos: Los tejidos fueron incluidos al menos 24 horas en paraformaldehído 4%.
Luego de embebidos en parafina, se hicieron cortes de 4 micrones y las
tinciones fueron hechas con hematoxilina y eosina (H&E).
PCR a
tiempo real: Los tejidos de rodilla fueron procesados de inmediato, en frío, para la
extracción de ARN. Los tejidos intestinales fueron congelados a -80ºC hasta
el momento de la extracción. A partir del ARN se obtuvo ADNc, el cual fue usado para los experimentos
realizados en un ciclador Applied Biosystem 7500. Los resultados fueron analizados con 7500
System SDS Software.
Permeabilidad Intestinal in vivo: la permeabilidad intestinal fue
determinada midiendo la cantidad de FITC- dextran en sangre luego de su
administracion oral como se describio previamente (13).
Análisis
estadistico: las
diferencias significativas entre grupos experimentales fueron determinadas por
analisis de varianza de una via (ANOVA) seguida dei test de Tukey para
múltiples comparaciones. Los valores de P de menos de 0.05 fueron considerados
estadísticamente significativos.
Resultados
Analizamos el efecto de la consumición de L. casei sobre la respuesta
inflamatoria a la enterocolitis (EC) inducida por S. Enteritidis. Los grupos de animales estudiados fueron: 1:
EC: recibió estreptomicina y Salmonella; 2: L. casei + EC: recibió
Lactobacillus casei, estreptomicina y Salmonella; 3: Control: animales sin
tratar; y 4: L. casei + Strep: ratones
que recibieron únicamente el probiótico y estreptomicina.
Cuarenta y ocho horas luego de la infeccion, los animales del grupo EC
presentaron signos de enfermedad, incluyendo diarrhea, pelos erizados y
letargia. Encontramos que S. Enteritidis induce una enterocolitis difusa,
caracterizada por un epitelio disminuido en altura, con infiltrado mononuclear
en la mucosa y submucosa y perdida de la arquitectura normal de las
vellosidades. La administración de L. casei durante una semana previa a la
infección, previno los cambios histológicos (grupo L. casei + EC) asi como
también la aparición de los síntomas clínicos.
El efecto protectivo de L. casei observado en el epitelio intestinal y a
nivel clínico puede estar relacionado a la disminución de la invasión
bacteriana observada en el grupo L. casei + EC. Nuestros resultados claramente
indican que la consumición de L. casei drásticamente disminuye la invasividad
de S. Enteritidis y acorta su persistencia en el bazo. El epitelio intestinal
preservado y la disminución en la invasividad inducida por L. casei se
correlacionaron con un 100% de sobrevida en animales del grupo L. casei + EC. Aproximadamente
20% de los ratones con enterocolitis por Salmonella mueren hacia el día 7 post
infección (8). Sin embargo, no ocurrieron muertes entre animales pertenecientes
al grupo que ingirió L. casei.
Ha sido demostrado que la permeabilidad intestinal decrece durante la
enterocolitis (7). Para investigar el efecto de L. casei en la permeabilidad
intestinal durante la enterocolitis por Salmonella, administrados una dosis
única de FITC?dextran con una jeringa a los animales a los dos días post
infección y medimos la intensidad de la fluorescencia en sueron 5 horas
después. El aumento de la permeabilidad intestinal a las macromoléculas
inducido por Salmonella (grupo EC) disminuyó a los niveles observados en
ratones controles en animales alimentados con L. casei previo a la
enterocolitis (grupos Control y L. casei + EC).
Rápido luego de la infección intestinal, S. enterica induce un aumento
significativo en la expresión de IL-17 y citoquinas relacionadas tales como
TNF-α, IL-1β, IL-6 y IL-23 (5,
8). Encontramos que los animales alimentados con el probiótico (grupo L. casei
+ EC) no respondieron a la infección con el patógeno, ya que la expresión de
IL-17 y de las citoquinas relacionadas a la misma fue similar a la observada en
ratones no infectados. Este efecto anti- inflamatorio generado por L. casei fue
más dramático en el ganglio mesentérico.
Conclusión
Aquí demostramos que la consumición de L. casei
previo a la infección intestinal impide la enterocolitis generada por
Salmonella; el porcentaje de sobrevida, la invasividad y persistencia de
Salmonella mejoraron. A su vez, los cambios histológicos y el aumento en la
permeabilidad intestinal se evitaron.
En el presente trabajo expusimos que la consumición
de L. casei previene la respuesta intestinal de IL-17, entre otras citoquinas,
frente a Salmonella. En un trabajo previo (8), nosotros determinamos que la
neutralización de la IL-17 sistémica
inhibía la generación de enterocolitis. Luego de la infección por Salmonella el
eje IL-23/IL-17 es gatillado en la mucosa intestinal. Los macrófagos y células
dendríticas infectadas con Salmonella son una fuente potencial de IL-23, una
citoquina que ayuda a amplificar la respuesta inflamatoria en el tejido
intestinal. Así, la IL-23 producida
por los fagocitos, estimula a las células T a secretar IL-17 (5). Diferentes
subtipos de células T, como Th17, γδ y NKT, presentes en la mucosa y lamina propria
intestinal expresan el receptor para IL-23 y son una importante fuente de IL-17
durante la infección por Salmonella (5, 11).
Las células Th17, γδ y NKT han sido
implicadas como generadoras de IL-17 en diferentes modelos de inflamación (4). Por
el otro lado, la diferenciación de las células Th17 y células T γδ requiere de un
ambiente específico de citoquinas el cual incluye IL-1β, IL-6 IL-23 y TGF-β (2).
Aquí, mostramos que la expresión de estas
citoquinas es inducida durante la enterocolitis por Salmonella y que se impide
mediante la consumición de L. casei. Nuestros resultados sugieren que la
consumición de L. casei altera el microambiente necesario para la
diferenciación de las células inmunes.