INVESTIGADORES
RUYBAL paula
congresos y reuniones científicas
Título:
EPIDEMIOLOGIA Y FILOGENIA MOLECULAR DE LEPTOSPIRA SP. EN ARGENTINA
Autor/es:
RUYBAL PAULA; MELENDEZ YAMIL; BRIHUEGA BIBIANA; LOPEZ SEBASTIAN; KOVAL ARIEL; CAIMI KARINA
Lugar:
Mercedes, Corrientes
Reunión:
Otro; XVIII Reunión Científico técnica de la Asociación Argentina de Veterinarios de Laboratorio de Diagnóstico; 2010
Resumen:
Introducción: La Leptospirosis es una enfermedad infecciosa causada por espiroquetas del género Leptospira sp. que es considerada la zoonosis de mayor distribución mundial (1). En humanos, la enfermedad tiene un amplio rango de síntomas que varían desde una infección subclínica a un síndrome severo con alta tasa de mortalidad. La leptospirosis esta presente en el ganado, animales domésticos y silvestres. En los últimos años se registraron distintos brotes en nuestro país que afectaron tanto a la sanidad animal como a la Salud Pública. El objetivo de este trabajo fue la caracterización genotípica de aislamientos de Leptospira sp. provenientes de diversas regiones de la Argentina. El presente estudio describe la aplicación del método de tipificación y caracterización filogenética de última generación Multilocus sequence typing (MLST), siendo esta la primera vez que se aplica este tipo de análisis en nuestro país. Esto permitirá obtener información sobre la estructura poblacional de los aislamientos circulantes de Leptospira sp, lo que contribuirá al desarrollo de programas de control de esta enfermedad en nuestro país. Materiales y Métodos: Cepas: Las cepas utilizadas pertenecen a las colecciones de L. interrogans presentes en el laboratorio de Leptospirosis del Instituto de Patobiología de INTA Castelar y de la empresa Biogenésis Bagó. Las cepas fueron propagadas en medio semisólido de Fletcher o en medio líquido EMJH. Se tomó una alícuota de 500 µl de cada suspensión bacteriana y se inactivó a 100C durante 30 min. Luego de la inactivación se realizó un lavado en Tris-EDTA (TE) 1X y 5 µl de este sobrenadante fueron utilizados en la reacción de PCR.MLST: La estrategia utilizada fue desarrollada por Thaipadungpanit y col (2). Las condiciones de la reacción de PCR fueron las siguientes: 5X PCR buffer, 5 mM MgCl2, 100 mM DNTPs, 10 pmol de cada set de primers, 0.05 U de Taq Polimerasa (Promega) y 5 μL de templado en un volumen final de 50 μl por reacción. Luego de 30 ciclos de amplificación (94°C 30 seg. 50°C 15 seg. para los genes glmU y fadD o 52°C para pntA, sucA, pfkB, tpiA y mreA; 72◦C, 50 seg. y una extensión final de 7 min. a 72◦C), los productos de PCR se analizaron en geles de agarosa 1% y purificados por precipitación con EDTA-Etanol. Los fragmentos amplificados fueron secuenciados en la Unidad de Genómica del Instituto de Biotecnología. Las secuencias se analizaron utilizando el software Staden Package (MRC-LMB, UK). Los perfiles alélicos (ST) fueron determinados en base a las secuencias publicadas en la base de datos internacional: http://leptospira.mlst.net. Las secuencias concatenadas se sometieron a reconstrucción filogenética por el método Neighbor-Joining, Kimura-2-parámetros (MEGA 3.1).Resultados: Los perfiles alélicos encontrados fueron el ST37, el ST17 y ST58. Dichos STs corresponden a L. interrogans serogrupos Pomona, Icterohaemorragiae y Serjoe, respectivamente. Entre las cepas pertenecientes al serogrupo Pomona se observaron nuevas variantes alélicas de los genes glmU y pfkB, dando como resultado STs no descriptos previamente y que determinarian variantes genéticas de dicho serogrupo. El dendograma obtenido utilizando las secuencias concatenadas de los siete genes mostró una topología con dos grandes clados congruente con la agrupación de cepas pertenecientes a los serogrupos mencionados anteriormente. La incorporación de las cepas de referencia fue de suma importancia a fin de contextualizar las relaciones filogenéticas de las cepas locales. De este modo, utilizando la base de datos internacional fueron incluidas en el análisis las secuencias correspondientes a las siguientes cepas de referencia: L. i. serovar Copenagheni (cepa M20, ST17), L. i. serovar Hardjoprajitno (cepa Hardjoprajitno, ST20), L. i. serovar Lai (cepa Lai, ST1), L. i. serovar Australis (cepa Ballico, ST51), L. i. serovar Roumanica (cepa LM294, ST58), L. i. serovar Sumneri (cepa Sumneri, ST7), L. i. serovar Pomona (cepa Pomona, ST37), L. i. serovar Manilae (cepa LT398, ST57), L. i. serovar Valbuzzi (cepa Valbuzzi, ST61), L. kirchneri serovar Grippotyphosa (cepa Moskva, ST62). También fueron incluidas las secuencias de L. i. serovar Pyrogenes (cepas Salinem, ST13) y L. i. serovar Pomona (cepas UT364, ST38).Dentro de uno de los dos grandes clados pudieron observarse sub-clados con alto soporte de rama, correspondientes a los serogrupos Icterohaemorragiae y Serjoe.Por otro lado la sensibilidad obtenida en la amplificación por PCR del fragmento correspondiente del gen fadD resultó significativamente menor impidiendo la determinación de los STs de cepas cuyos cultivos presentaron menor densidad de crecimiento. Por este motivo, se llevó a cabo un análisis filogenético excluyendo dicho gen de la secuencia concatenada de los siete loci. El dendograma obtenido en este caso, mostró idéntica topología de clados y sub-clados que el obtenido anteriormente.Conclusiones: Mediante la aplicación de MLST se obtuvo una distribución de serogrupos concordante con la obtenida por el método serológico de referencia. El método molecular de tipificación aplicado hasta hoy en la Argentina es el análisis por repeticiones en tándem de número variable (VNTRs). Dicha técnica permitió discriminar en clados correspondientes con los serogrupos estudiados. Sin embargo mediante la metodología de MLST se describieron nuevas variantes genéticas dentro del clado correspondiente con el serogrupo Pomona, lo que indica el mayor poder discriminativo de esta técnica. Esto resulta importante para el estudio de brotes de la enfermedad, como fuera observado en el trabajo de Thaipadungpanit y col (2). Asimismo dicho análisis filogenético arrojó la misma topología del cladograma al excluir del mismo al gen fadD, esto demuestra que la secuencia blanco de dicho gen no resulta significativamente informativa a fin de describir nuevas variantes genéticas. La baja sensibilidad obtenida en la amplificación por PCR de dicho gen, puede deberse a dos razones: La utilización del lisado bacteriano como templado de la reacción de PCR en lugar del uso de ADN purificado por métodos comerciales y por otra parte a que el gen fadD, se encuentra en el cromosoma II de menor peso molecular, lo que lo hace más suceptible a degradación en la lisis bacteriana; mientras que los 6 genes restantes se encuentran en el cromosoma I de mayor peso molecular y por ende más resitente al lisado. Finalmente y con el objetivo de profundizar el análisis de variantes genéticas entre e intra serovares, se esta evaluando la aplicación de un segundo diseño de MLST desarrollado por Ahmed y col (3). Esto permitirá profundizar el estudio de la estructura poblacional de las cepas de Leptospira relevantes en Salud Pública y Sanidad Animal en Argentina. 1- World Health Organization. 1999. Leptospirosis worldwide, 1999. Wkly.Epidemiol. Rec. 74:237?242. 2- Thaipadungpanit J. et al. A Dominant Clone of L. interrogans Associated with an Outbreak of Human Leptospirosis in Thailand. 2007;1:1-6. 3- Ahmed N. et al. Multilocus sequence typing method for identification and genotypic classification of pathogenic Leptospira species. Annals of Clin Microbiol and Antimicrobials. 2006, 5:28.