Desarrollo de un esquema de tipificación por secuenciación de locus múltiples (MLST) en Babesia bigemina

GUILLEMI ELIANA; RUYBAL PAULA; PRINCIPI DARIO; DELFINO SANTIAGO; FARBER MARISA; WILKOWSKY SILVINA

Otro; XXIV Reunión Científica Anual Sociedad Argentina de Protozoología; 2010

La babesiosis causada por el protozoario Babesia bigemina es una enfermedad hemoparasitaria de los bovinos que causa importantes perdidas economicas a la ganaderia. El objetivo de este trabajo fue desarrollar un esquema de MLST para B. bigemina para estimar la estructura poblacional y la diversidad genotipica de aislamientos de distinto origen. Se identificaron 20 genes de B. bigemina  por TBLASTN contra los contigs del genoma utilizando como consulta los genes ortologos de B. bovis. Luego de amplificar por PCR y secuenciar un fragmento promedio de 700 pb., se seleccionaron 6 en base a la cantidad de sitios polimorficos; distribucion por ortologia en los cromosomas de B. bovis, ausencia de presion selectiva (dN/dS menor a 1) y especificidad de los oligonucleotidos frente a ADN heterologo. Los genes seleccionados fueron: cyp, dnaJ, rcc, sbp3, sbp4 y zfc. Se analizaron 7 cepas de referencia argentinas (M1A, M1P, M2P, S1A, S2A, S2P y S3P), 2 cepas de referencia extranjeras (Mexico patogena y Brasil atenuada),  1 caso agudo de B. bigemina de Salta (B38) y la cepa australiana virulenta del proyecto genoma. Se establecieron los haplotipos o "sequence type" (ST) resultantes de la combinacion unica de los alelos concatenados y se obtuvieron 9 STs diferentes para los 11 aislamientos analizados. La aplicacion del test de Chi cuadrado maximo para evaluar la recombinacion intragenica arrojo un resultado negativo (p>0.05) para todos los genes. En consecuencia, los datos indicaron una estructura poblacional acorde al modelo clonal, siendo la reconstruccion filogenetica el metodo adecuado de analisis. Utilizando el metodo Neighbour-Joining (programa MEGA 3.1) se obtuvo el arbol filogenetico a partir de las secuencias concatenadas. El analisis del dendograma arrojo dos grupos bien definidos para las cepas de origen argentino que agruparon a las cepas de caracter patogeno (M1P, M2P, S2P, S3P) separadas de las atenuadas (M1A, S1A y S2A). Si bien las cepas no argentinas no se agruparon junto con las locales, la cepa brasileña se mantuvo en el mismo clado que las atenuadas argentinas en cambio la mexicana permanecio en el clado correspondiente a las patogenas. En vista de estos resultados podemos concluir que el empleo de la tecnica de MLST para Babesia bigemina es una herramienta util para la discriminacion de aislamientos de distinto fenotipos y origen geografico y que su utilizacion a mayor escala con muestras de campo permitir a obtener informacion acerca de la distribucion espacial de los genotipos presentes en nuestro pais.