Multilocus Sequence Typing (MLST) para la tipificación molecular de Anaplasma marginale

GUILLEMI ELIANA; PRINCIPI DARIO; DELFINO SANTIAGO; WILKOWSKY SILVINA; FARBER MARISA; RUYBAL PAULA

Congreso; XX Congreso Latinoamericano de Microbiologia; 2010

Para el estudio epidemiológico de Anaplasma marginale es necesario contar con un sistema de tipificación altamente reproducible y discriminativo. Solo dos marcadores moleculares han sido descriptos y aplicados en este tipo de análisis (filogeográfico MSP4 y de genotipo MSP1). El objetivo de este trabajo fue desarrollar un esquema MLST para lograr obtener una descripción más precisa de la diversidad genotípica de este patógeno en bovinos infectados. Los genes seleccionados para este esquema fueron: dnaA, ftsz, groEL, lipA, recA, secY y sucB. Estos genes están distribuídos en el genoma, son de copia única y son selectivamente neutros de acuerdo a la relación dN/dS menor a uno. La variabilidad genética fue estudiada por PCR seguida de secuenciación y posterior  análisis de SNPs (single nucleotide polymorphism) de estos 7 fragmentos génicos concatenados. Se estableció un haplotipo o “sequence type” (ST) a la combinación única de alelos para estos 7 genes. Se verificó la especificidad para A. marginale de todos los iniciadores utilizando ADN heterólogo. Se analizaron las 5 secuencias genómicas disponibles (Saint Marie, Mississippi, Puerto Rico, Florida y Virginia), 3 aislamientos extranjeros (Africa, Oklahoma y South Idaho), 5 aislamientos argentinos de referencia (Mercedes, Virasoro, Salta, Rosali y Quitilipi) y 26 aislamientos de campo del norte argentino. Estos últimos provienen de bovinos crónicamente infectados distribuídos en la región enzoótica para la enfermedad. Los resultados mostraron que sobre un total de 39 aislamientos estudiados se obtuvieron 33 STs diferentes, lo que indica que si bien los genes seleccionados son conservados, la variabilidad a nivel de SNPs es muy alta.El análisis de los dendogramas para cada gen por Neighbor-joining y Máxima Parsimonia mostró que no existe concordancia en la topología de los árboles entre sí. Esto sugirió la existencia de eventos de recombinación intragénica, que fue posteriormente confirmado para los genes ftsz, recA y sucB utilizando el test de Máximo Chi Cuadrado con un  p menor o igual a 0.05. A partir de esta comprobación, se aplicó un estudio de asociación de STs utilizando el software eBurst V3. Como resultado de este análisis se obtuvieron tres grupos, dos de los cuales se constituyeron con un ST fundador. Uno de estos dos grupos está conformado por STs de aislamientos norteamericanos y el otro por STs de aislamientos argentinos. Estos grupos no incluyeron 7 de los 35 STs obtenidos pudiendo deberse a la dispersión geográfica de los aislamientos.