FORMACIÓN DE COMPLEJOS POLIETILENIMINA CON CITRATO Y FOSFATO.

MANZUR, ALEJANDRA; SPELZINI, DARÍO; FARRUGGIA, BEATRIZ; ROMANINI, DIANA; PICÓ, GUILLERMO

Capital Federal

Congreso; XI CONGRESO ARGENTINO DE FARMACIA Y BIOQUIMICA INDUSTRIAL; 2007

Asociación Argentina de Farmacia y Bioquímica

Los pollímeros cargados pueden ser de origen natural como artificial. En solución, tienen la particularidad precipitar en presencia de un contraión en un dado rango de pH para formar complejos insolubles que pueden ser redisueltos modificando las condiciones del medio. El contraión pude ser una proteína o un anión inorgánico polivalente. Esta propiedad se ha sido empleada en  los últimos años como estrategia para la purificación de proteínas a partir de su fuente natural. Los polielectrolitos que interactúan con pequeños iones de carga opuesta pueden formar complejos insolubles los cuales pueden poseer carga neta positiva o negativa, dependiendo de la estequiometría molar polímero/anión. Precipitan en un rango de pH (DpH) donde se comportan como polianfolitos. El comportamiento de polietilenimina (PEI) (un polímero catiónico sintético de pK 9.6) en presencia de fosfato (Pi) o de citrato (Cit) fue investigada por turbidimetría. La variación de absorbancia a 420nm  fue ensayado variando el pH, la concentración de polímero y la fuerza iónica. La formación de éstos complejos fue ensayada para su potencial aplicación para aislar proteínas modelo de distinto punto isoeléctrico. Ambos complejos (PEI-fosfato u PEI-citrato) no mostraron exactamente el mismo valor de pH de precipitación a causa de que los complejos poseen estequiometría diferente. Sus pHs isoeléctricos resultaron ser  5.5 y 6.2, respectivamente. Los complejos precipitados fueron redisueltos reversiblemente en NaCl  a concentraciones por encima de 0,5M. Los diagramas de fase mostraron que el punto isoeléctrico fue independiente para las distintas relaciones PEI/anión ensayadas .             La precipitación se ensayó a pH 5,5 en presencia de tres proteínas modelo: albúmina sérica bovina (pI 4,8), lisozima (pI 11,2) y pepsina (pI 2,5). El recupero de pepsina fue del 98%, en citrato y 87% en fosfato mientras que el de albúmina fue menor al 5% y el de lisozima de 0% para ambos sistemas. Los complejos insolubles fueron disueltos en NaCl 2,5M. Estudios de estabilidad térmica de pepsina (por calorimetría diferencial de barrido) mostraron que la presencia de PEI incrementa la temperatura de desnaturalización de la enzima lo que demuestra un efecto protector del polímero frente a la desnaturalización térmica. Espectros de dicroismo circular de pepsina muestran que, en presencia del polímero, no hay perdida de la estructura secundaria y terciaria de la proteína. La presencia de PEI aumentó la actividad coagulasa de pepsina y no presentó variación en presencia del polímero a lo largo de 24hs. Estos resultados demuestran que es posible usar este método para aislar enzimas ácidas  de su fuente natural. En nuestro laboratorio se están llevando a cabo experimentos utilizando estos complejos para  purificar pepsina a partir de  estómago bovino y porcino.