Análisis termodinámico de la formación de complejos insolubles entre tripsina y Eudragit® L100 como base para diferentes aplicaciones biotecnológicas.

BRAIA, MAURICIO; NERLI, BIBANA; LOH, WATSON; ROMANINI, DIANA

Córdoba

Congreso; . XVII Congreso Argentino de Fisicoquímica y Química Inorgánica. Organizado por la Asociación Argentina de Investigación Fisicoquímica; 2011

Asociación Argentina de Investigacion Fisicoquímica

ANÁLISIS TERMODINÁMICO DE LA FORMACIÓN DE COMPLEJOS INSOLUBLES ENTRE TRIPSINA Y EUDRAGIT® L100 COMO BASE PARA DIFERENTES APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS Mauricio Braiaa, Bibiana Nerlia, Watson Lohb y Diana Romaninia aLab. de Fisicoquímica Aplicada a Bioseparación. Fac.de Cs. Bioquímicas y Farm. Universidad Nacional de Rosario - CONICET. bInstituto de Química. Universidad Estadual de Campinas (UNICAMP). Campinas, SP. Brasil.mjbraia_fbioyf@hotmail.coma, Bibiana Nerlia, Watson Lohb y Diana Romaninia aLab. de Fisicoquímica Aplicada a Bioseparación. Fac.de Cs. Bioquímicas y Farm. Universidad Nacional de Rosario - CONICET. bInstituto de Química. Universidad Estadual de Campinas (UNICAMP). Campinas, SP. Brasil.mjbraia_fbioyf@hotmail.comLab. de Fisicoquímica Aplicada a Bioseparación. Fac.de Cs. Bioquímicas y Farm. Universidad Nacional de Rosario - CONICET. bInstituto de Química. Universidad Estadual de Campinas (UNICAMP). Campinas, SP. Brasil.mjbraia_fbioyf@hotmail.combInstituto de Química. Universidad Estadual de Campinas (UNICAMP). Campinas, SP. Brasil.mjbraia_fbioyf@hotmail.com Introducción: la formación de complejos insolubles entre proteínas y polímeros de cadena flexible con carga eléctrica (polielectrolitos) posee diversas aplicaciones biotecnológicas e industriales inmovilización de enzimas en un reactor, bioseparación de proteínas por precipitación a partir de una mezcla compleja y estabilización de enzimas. En los últimos años han surgido los denominados polímeros “inteligentes”, los cuales se destacan por precipitar reversiblemente debido a cambios rápidos en su microestructura, producto de la modificación de parámetros experimentales como el pH. Un polímero muy atractivo para estos usos es el Eudragit® L-100 (EL100) que se caracteriza por presentar carga negativa; ser sintético y biodegradable. Del mismo modo, una enzima de alto valor industrial y biotecnológico es la tripsina (TRP): una endopeptidasa básica de 23,4 kDa utilizada en la clarificación de cerveza, el ablandamiento de cueros, la elaboración de cremas para hematomas y la producción de insulina. Estudiando las variables   experimentales que influyen la formación de estos complejos se pueden encontrar las condiciones óptimas de interacción entre el polímero y la enzima de interés [1]. En trabajos anteriores se determinó que el pH óptimo de interacción es 5,00 y que la estabilidad estructural de la TRP al interaccionar con el EL100 no se ve afectada a este pH.la formación de complejos insolubles entre proteínas y polímeros de cadena flexible con carga eléctrica (polielectrolitos) posee diversas aplicaciones biotecnológicas e industriales inmovilización de enzimas en un reactor, bioseparación de proteínas por precipitación a partir de una mezcla compleja y estabilización de enzimas. En los últimos años han surgido los denominados polímeros “inteligentes”, los cuales se destacan por precipitar reversiblemente debido a cambios rápidos en su microestructura, producto de la modificación de parámetros experimentales como el pH. Un polímero muy atractivo para estos usos es el Eudragit® L-100 (EL100) que se caracteriza por presentar carga negativa; ser sintético y biodegradable. Del mismo modo, una enzima de alto valor industrial y biotecnológico es la tripsina (TRP): una endopeptidasa básica de 23,4 kDa utilizada en la clarificación de cerveza, el ablandamiento de cueros, la elaboración de cremas para hematomas y la producción de insulina. Estudiando las variables   experimentales que influyen la formación de estos complejos se pueden encontrar las condiciones óptimas de interacción entre el polímero y la enzima de interés [1]. En trabajos anteriores se determinó que el pH óptimo de interacción es 5,00 y que la estabilidad estructural de la TRP al interaccionar con el EL100 no se ve afectada a este pH. Objetivo: analizar la formación del complejo insoluble EL100-TRP por calorimetría de titulación isotérmica (ITC) determinando la relación molar polímero/proteína (n), la constante de afinidad (k) y las funciones termodinámicas ΔH, ΔS y ΔG como base para diagramar una estrategia de precipitación que permita calcular el porcentaje de TRP que forma parte del complejo.analizar la formación del complejo insoluble EL100-TRP por calorimetría de titulación isotérmica (ITC) determinando la relación molar polímero/proteína (n), la constante de afinidad (k) y las funciones termodinámicas ΔH, ΔS y ΔG como base para diagramar una estrategia de precipitación que permita calcular el porcentaje de TRP que forma parte del complejo. Resultados: los experimentos de ITC realizados en buffer a pH 5,00 arrojaron los siguientes parámetros de fijación: n=15 moles TRP/mol EL100, k=9,79.106 M-1, ΔH=62.140 cal/mol, ΔS=240 cal/K.mol y ΔG=-9.598,56 cal/mol. Los experimentos realizados en las mismas condiciones que los anteriores pero trabajando en presencia de NaCl 1,00 M mostraron que la fuerza iónica disminuye notablemente la fijación de la enzima al polímero. El experimento de precipitación de la TRP bajo las condiciones estudiadas dio un porcentaje de enzima precipitada de 76,21%.los experimentos de ITC realizados en buffer a pH 5,00 arrojaron los siguientes parámetros de fijación: n=15 moles TRP/mol EL100, k=9,79.106 M-1, ΔH=62.140 cal/mol, ΔS=240 cal/K.mol y ΔG=-9.598,56 cal/mol. Los experimentos realizados en las mismas condiciones que los anteriores pero trabajando en presencia de NaCl 1,00 M mostraron que la fuerza iónica disminuye notablemente la fijación de la enzima al polímero. El experimento de precipitación de la TRP bajo las condiciones estudiadas dio un porcentaje de enzima precipitada de 76,21%. Conclusiones: el análisis de los parámetros de la fijación obtenidos por ITC suponiendo un modelo de sitios independientes y equivalentes mostró un predominio de un efecto hidrofóbico demostrado por los valores positivos de ΔH y ΔS. Estos resultados indican que el proceso de unión de TRP al EL100 está conducido entrópicamente. Sin embargo, el efecto inhibidor observado por el aumento de la fuerza iónica hace sospechar de la presencia de un componente electrostático en la interacción. Se observó además que 15 moléculas de TRP se unen a una de  polímero.Por otro lado, el sistema mostró una gran eficiencia de precipitación de TRP.el análisis de los parámetros de la fijación obtenidos por ITC suponiendo un modelo de sitios independientes y equivalentes mostró un predominio de un efecto hidrofóbico demostrado por los valores positivos de ΔH y ΔS. Estos resultados indican que el proceso de unión de TRP al EL100 está conducido entrópicamente. Sin embargo, el efecto inhibidor observado por el aumento de la fuerza iónica hace sospechar de la presencia de un componente electrostático en la interacción. Se observó además que 15 moléculas de TRP se unen a una de  polímero.Por otro lado, el sistema mostró una gran eficiencia de precipitación de TRP. Referencias bibliográficas: [1] D. Romanini, M. Braia, R. Giatte Angarten, W. Loh, G. Picó, Interaction of lysozyme with negatiely charged flexible chain polymers, Journal of Chromatography B 857D. Romanini, M. Braia, R. Giatte Angarten, W. Loh, G. Picó, Interaction of lysozyme with negatiely charged flexible chain polymers, Journal of Chromatography B 857 (2007) 25-31.