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Introducción: Con el desarrollo de la Biotecnología en los últimos años se ha extendido el empleo de enzimas en procesos de fabricación de alimentos, fármacos y en diferentes procesos industriales. La formación de complejos insolubles entre proteínas y polímeros de cadena flexible con carga eléctrica han surgido como una alternativa en distintas áreas de la biotecnología: en la bioseparación de proteínas de interés, en la inmovilización de enzimas en biorreactores y en el desarrollo de nanotecnologías. Los polímeros de cadena flexible con carga eléctrica son comúnmente denominados polielectrolitos (PE). La formación de complejos insolubles entre proteínas y polímeros bajo ciertas condiciones del medio ha permitido separar una proteína de una mezcla compleja por simple precipitación. El objetivo de este trabajo fue analizar la capacidad de los polielectrolitos de formar complejos con tripsina como punto de partida para aplicar este sistema al desarrollo de procesos de bioseparativos que puedan ser aplicados a escala industrial. La hipótesis general de trabajo se basa en utilizar la capacidad de diferentes PE de formar complejos insolubles con proteasas, los cuales son fácilmente separados del resto del sistema, y luego disociar la proteína del PE de manera de recuperar esta manteniendo su actividad biológica. El conocimiento del mecanismo molecular mediante el cual se lleva a cabo este proceso nos permitirá diseñar nuevos métodos de aislamiento y purificación de proteasas con múltiples aplicaciones en la industria y de alto valor comercial. Materiales y Métodos: Como modelo de enzimas de alto valor comercial se han seleccionado tripsina de páncreas porcino. Los PE seleccionados son naturales y sintéticos de bajo impacto ambiental: polivinilsulfonato de sodio (PVS), poliacrilato de sodio (PAA) fueron adquiridos en Sigma Chemical Co, USA. La metodología se basa en realizar diagramas de solubilidad a diferentes relaciones molares de polímero/proteína. Se analizan los rangos de pH para los cuales el complejo es insoluble utilizando tripsina porcina purificada. Los mismos diagramas se repitieron en presencia de fuerzas iónicas crecientes. Se ensayó la precipitación y se separó el sobrenadante del precipitado. De acuerdo al PE utilizado, el precipitado se redisolvió modificando la fuerza iónica o directamente con un buffer de pH donde la enzima es soluble y la actividad enzimática máxima. Se determinó la actividad enzimática y el contenido de tripsina a cada una de estas fracciones. El mismo procedimiento se realizó sobre la proteína purificada y sobre el homogenado de páncreas y se calcularon el rendimiento (R%) y el factor de purificación (FP) de tripsina pancreática aplicando metodología determinada para cada PE. Para evaluar la estabilidad de la TRP formando parte de los complejos, se determinó la actividad enzimática a diferentes tiempos a lo largo de 24hs a temperatura ambiente. Resultados: Los diagramas de solubilidad de los complejos tripsina/PE mostraron que éstos son insolubles a pHs menores a 6,0 para el complejo TRP-PVS y 5,0 para TRP-PAA. Ambos complejos fueron precipitados a pH 3,0. Los moles de TRP precipitados por mol de PE fueron de 228 para PVS y 148 para PAA. La redisolución del precipitado en el caso de los complejos TRP-PVS se realizó adicionando una solución buffer pH 7,0 con 0,5M de NaCl, en cambio para TRP-PAA, el cambio de fuerza iónica del medio no fue suficiente para redisolver el precipitado y sólo fue necesaria la adición de buffer pH 7,0. Esta diferencia puede explicarse considerando un carácter electrostático predominante en la formación del primer complejo y un efecto mixto en el segundo. Se determinó la cinética de formación de los complejos determinando el tiempo necesario para alcanzar la máxima turbidez. En ambos casos la cinética fue rápida, de 1-2 minutos. De acuerdo a los resultados obtenidos en el estudio de variables que determinan la formación y disociación de estos complejos se procedió a la precipitación de la proteína purificada. Los resultados mostraron que una alta actividad enzimática de TRP (83,92%) fue recuperada de los complejos TRP-PVS al redisolver el precipitado, en cambio, algo menos (48,84%) para los complejos TRP-PAA. Cuando el procedimiento se aplicó a un homogenado de páncreas bovino, el FP obtenido para TRP-PVS fue de 4,43 y el R de 74,79 %. En cambio, para TRP-PAA el FP fue 5,94 y el R 88,75 %. Por otro lado se analizó la estabilidad de TRP se observó que PVS prácticamente no modifica la actividad enzimática para cada uno de los tiempo ensayados. Para PAA se observó un efecto diferente ya que este polímero disminuye la actividad de TRP pero la mantiene sin variaciones a través del tiempo, teniendo a las 24hs prácticamente la misma actividad que la enzima que fue incubada sin polímero. Si bien los efectos son diferentes para ambos polímeros contribuyen a la estabilización de la enzima en el tiempo. Los resultados obtenidos en la presente investigación serán útiles en áreas productivas, como consecuencia que la misma estudia un paso importante de los procesos biotecnológicos. Conclusiones: El trabajo aborda la formación de complejos que pueden precipitar y redisolverse que pueden ser el punto de partida de una metodología que puede tener proyecciones en la obtención, purificación, estabilización e inmovilización, y que además permitan aplicarse a gran escala. Cuando las condiciones ensayadas se aplicaron a la bioseparación de TRP a un homogenado de páncreas porcino, se obtuvieron resultados promisorios que permitieron recuperar una cantidad considerable de enzima con relativa pureza aplicando una metodología rápida, sencilla y de bajo costo y que además los PE empleados tengan un rol estabilizante a través del tiempo. También se han contemplado, el bajo impacto en el medio ambiente ya que se requieren muy bajas concentraciones de PE.

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