APLICACIÓN DE UN DISEÑO EXPERIMENTAL DE BIOSEPARACIÓN UTILIZANDO POLIVINILSULFONATO A UN HOMOGENADO DE PÁNCREAS PORCINO PARA LA PURIFICACIÓN DE TRIPSINA

BRAIA, MAURICIO; PICÓ, GUILLERMO; ROMANINI, DIANA

Rosario

Congreso; X Congreso y XXVIII Reunión de la Sociedad de Biología de Rosario; 2008

Sociedad de Biología de Rosario

La tripsina es considerada una de las proteínas de mayor interés comercial ya que es utilizada en numerosos procesos industriales y biotecnológicos. Por ello, es importante poder purificarla a partir de su fuente natural de manera rápida, efectiva y económica. Un procedimiento ampliamente utilizado para la bioseparación de proteínas es la formación de complejos entre estas biomoléculas y polímeros de cadena flexible con carga eléctrica (polielectrolitos). Estos complejos pueden ser solubles o insolubles dependiendo de las condiciones del medio: pH, temperatura, fuerza iónica. En trabajos previos hemos diseñado un método experimental de bioseparación de tripsina partiendo de la tripsina purificada. En este caso, el objetivo fue aplicar condiciones experimentales determinadas a un homogenado de páncreas porcino y lograr, por formación de complejos solubles-insolubles, separar a la tripsina de dicha mezcla compleja. El procedimiento consistió en adicionar 100mL de PVS 0,25% p/v, pH 3,00 a 1mL de un homogenado de páncreas porcino preparado en buffer Tris-HCl 50mM pH 8,00. La mezcla se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente y luego se centrifugó a 3000 rpm. El precipitado fue redisuelto en dos medios diferentes: buffer fosfato 50 mM pH 7,00 [NaCl] 1M y buffer Tris-HCl pH 8,00 hasta alcanzar el volumen inicial. Se procedió luego a determinar la actividad enzimática utilizando la capacidad de esta enzima de hidrolizar el sustrato BAPNA (a-N-benzoil-L-Arginine-p-nitroaniline) y a la determinación de la concentración de las proteínas totales y ADN por el método de Warburg en todas las fracciones. Los factores de purificación determinados en cada caso arrojaron valores de 1,97 y 4,43 y los rendimientos fueron de 32,19 y 79,74%, respectivamente para cada medio. Los resultados obtenidos aplicando el método de precipitación por formación de complejos insolubles tripsina-PVS mostraron una alta eficiencia y un alto recupero de la proteína de interés cuando se lo aplicó a la fuente natural, el homogenado de páncreas porcino. Los mejores resultados con respecto al factor de purificación y rendimiento se obtuvieron cuando se utilizó Tris-HCl para redisolver el precipitado.