Purificación a escala piloto de una actividad lipasa producida por Aspergillus niger MYA135. Caracterización cinética y molecular.

SALVATIERRA, HEBE NATALIA; DONAMARÍA, J; NAVARRO, A; BAIGORI, MARIO DOMINGO; WOLMAN, F; PERA, LICIA MARÍA

CABA

Congreso; XIV Congreso Argentino de Microbiologia General XIV SAMIGE; 2019

Introducción  y  Objetivos: Las  lipasas  (EC  3.1.1.3)  son  enzimas  de  gran  importancia  industrial  debido  a  la heterogeneidad  de  aplicaciones  que  presentan  en  la  industria  alimenticia,  farmacéutica  y  otras  y  en  la producción de biocombustibles. Cada una de estas aplicaciones requiere propiedades específicas de las lipasas tales  como  especificidad,  estabilidad  térmica,  habilidad  para  catalizar  la  síntesis  de  ésteres  en  solventes orgánicos, etc. En tal sentido, este trabajo tiene como objetivo purificar una actividad lipasa a escala piloto y caracterizar el producto obtenido. Materiales  y  Métodos: Para  esto,  se  obtuvo  3  l  de  sobrenadante  de  cultivo  con  actividad  lipasa  a  partir de Aspergillus  niger MYA  135  utilizando  un  medio  salino  suplementado  con  aceite  de  oliva  (2%,  v/v).  Se optimizó el proceso de purificación. Se propuso un paso de ultrafiltración seguido de cromatografía hidrofóbica por FPLC (Fast protein liquid chromatography). Resultados: Se logró purificar una proteína con una actividad específica de 13,4 U/mg, con un rendimiento de 6,2% y un factor de purificación de 17,8. La proteína purificada reveló dos bandas en SDS-PAGE. Las mismas fueron analizadas por espectrometría de masa MS y MS/MS, dando como resultado: a) para la banda superior, una  identificación  en  MASCOT  con  Lipasa  Extracelular  de Aspergillus  niger;  Masa:  61  kDa;  pI:  4,42;  Score:110; Base de datos: NCBIprot y b) para la banda inferior una identificación con Lipasa de Aspergillus niger CBS 513.88; Masa: 31,7 kDa; pI: 4,67; Score: 5,8; Base de datos: NCBIprot. Se determinaron: el punto isoeléctrico (3,75), temperatura (30°C) y pH (7.0) óptimos, y los parámetros cinéticos Vmax (19,16 μmol/min) y Km (0,26 mM), utilizando buffer A (buffer fosfato 100 mM pH 7, goma arábiga 0,1% y tritón 0,4%), una temperatura de incubación  de  37°C  y  p-nitrofenil  palmitato  como  sustrato.  Además,  se  estudió  el  efecto  de  agentes  que modifican  aminoácidos  (5  mM):  NAI  (N-acetylimidazole),  NBS  (N-bromosuccinimide),  EDAC  (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide), IA (idoacetate), DEPC (diethylpyrocarbonate), CA (citraconic anhydride) y PG (phenylglyoxal); y otros compuestos (g/l): FeCl3 1, CaCl2 0,5, ácido oleico 1, glicerol 10, aceite de oliva 20 y Tritón X100 20. Se detectó un efecto de inhibición frente a CA, NAI, PG, DEPC, CaCl2y Tritón; mientras que con el  agregado  de  FeCl3 (Ka=0,17mM)  y  ácido  oleico  (Ka=0,05mM)  se  observó  un  efecto  de  activación. Finalmente,  se  realizaron  estudios  relacionados  con  la  síntesis  de  biodiesel  utilizando  la  lipasa  purificada  e inmovilizada en silica gel por adsorción como catalizador, con aceite de soja crudo y butanol en relación (1:4). Conclusiones: Como resultado, se logró sintetizar biodiesel con éxito, pudiéndose comprobar que esta enzima tiene  la  capacidad  de  reaccionar  con  un  sustrato  natural  y  catalizar  la  transesterificación.  Agradecimientos: PICT 2015 2596 (FONCyT) y PIUNT 606 (UNT).