Purificación y caracterización de un exopolisacárido producido por Lecanicillium muscarium LY 72.14.

ARNAU VG; FARIÑA JI; DANILOVICH M; DELGADO OD

S. M. de Tucumán

Simposio; SAPROBIO 2018; 2018

SAPROBIO 2018

ResumenElobjetivo de este trabajo fue purificar y caracterizar un exopolisacárido (EPS) producidopor Lecanicillium muscarium LY 72.14.Para ello, se llevó cabo la producción del EPS en biorreactor empleando medioMOPT como medio de producción. Luego de la purificación por precipitaciones sucesivascon etanol 96°, se liofilizó y se realizaron estudios de caracterización, losque incluyeron composición porcentual del EPS, masa molecular relativa ycomposición de monosacáridos. Los resultados mostraron un EPS de elevado gradode pureza (< 88%), 7,9% de humedad y contenido de proteínas no detectablecon el método empleado; con una masa molecular relativa de 1,65 KDa y constituidopor monómeros de glucosa, galactosa y manosa. Palabras clavesExopolisacáridos,Lecanicillium muscarium, purificación,caracterización, masa molecular 1.         IntroducciónDurantelos últimos tiempos, se ha generado mucho interés con respecto a lospolisacáridos producidos por microorganismos fúngicos debido a sus diversasactividades farmacológicas, incluidas propiedades inmunoestimulantes yactividades antitumorales (Kuo y col., 1996; Lee col., 1990; Lee y Kang, 1996).Los biopolímeros microbianos se clasifican como homo- o heteropolisacáridosdependiendo de sus estructuras químicas. La mayoría de los EPS producidos porhongos filamentosos son β-glucanos altamente higroscópicos, lo que sugiere que suproducción podría estar relacionada con la tolerancia a la desecación; demanera similar a la observada y descripta en otras bacterias (Schnider-Keel ycol., 2001). Dichos EPS consisten en una gran variedad de glucanosestrechamente relacionados en estructura, pero que poseen diferentessolubilidades. La diferencia en la composición química, tipo de enlaceglicosídico y grado de ramificación de los polisacáridos, influyen tanto en la estructurasecundaria y terciaria de las cadenas individuales como en su estructuramacromolecular, determinando así las propiedades físico-químicas delpolisacárido, las que a su vez están relacionadas con sus funcionesestructurales o fisiológicas (Lim y col., 2005). El objetivo de este trabajofue purificar y caracterizar un EPS producido por Lecaniciillium muscarium LY 72.14 en condiciones de cultivosumergido, determinar la composición porcentual del mismo, estimar su masamolecular relativa y evaluar la composición en monosacáridos de la muestra. 2.         MetodologíaElEPS fue producido empleando un fermentador instrumentado BioFlo III (New BrunswickSci.), con un volumen de trabajo de 1 L y medio MOPT (Fariña y col., 1998) comomedio de producción. Luego de 7 d de cultivo, se procedió a la recuperación delcaldo libre de células. El sobrenadante fue precipitado con etanol 96° (2:1,v/v) y almacenado a 4°C durante 24 h. El EPS fue luego recuperado porcentrifugación y re-disuelto en agua bidestilada, el proceso de precipitacióncon etanol se repitió 3 veces y el EPS purificado fue finalmente liofilizado. Apartir del EPS purificado se preparó una solución 2 g L -1 en lacual se determinaron azúcares reductores por el método del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNSA) (Miller, 1959), azúcares totales por el método fenol-sulfúrico (Dubois y col., 1956),proteínas totales por el método del ácido bicinconínico y el porcentaje de humedad relativapor gravimetría. Para evaluar la masa molecular (MM) del EPS, se analizó unasolucion de 2 g L -1 del EPS purificado mediante cromatografía depermeabilidad en gel (GPC) por HPLC, empleando una columna Waters Ultrahydrogely NaNO3 0,1 M como fase móvil. Los polisacáridos se detectaron conun detector de índice de refracción diferencial Gilson RI 132. Finalmente, sellevó a cabo la hidrólisis ácida de 0,1 g de este EPS según el protocolo deAdams (1965), para determinar la composición demonosacáridos en el mismo. El sobrenadante conteniendo losproductos resultantes  de la hidrólisisfue analizado para determinar su contenido de azúcares mediante HPLC, empleandouna columna Phenomenex RPM- monosacáridos Pb2+, empleando H2Odestilada como fase móvil. Los resultados obtenidos fueron comparados con lostiempos de retención de estándares de azúcares. 3.         Resultados y discusión El EPS mostró una composición porcentual de 88% de azúcarestotales (de los cuales 14, 22% corresponden a azúcares reductores), 7,8% dehumedad y un porcentaje de proteínas no detectable por el método empleado, locual pone en evidencia la elevada pureza de la muestra y la eficiencia delproceso de recuperación/purificación. Cuando se estimó la masa molecular delEPS, se observó un único pico con un tiempo de retención de 13,26 min y alcomparar con el tiempo de elución de los estándares, se estimó una masamolecular relativa de 16,5 kDa. Finalmente, en cuanto a la composición demonosacáridos de la muestra, los hidrolizados resultantes mostraron 3 picos condiferentes tiempos de elución: 13,67 min, 15,69 min y 18,08 min, los que secorresponden con glucosa, galactosa y manosa. Considerando el área de los picosanalizados podríamos estimar que estos dos últimos monosacáridos se encuentranmayoritariamente en la muestra en una proporción (2:1) respecto a la glucosa.De igual manera, Yu y col., (2007) describieron una composición de monómeros deglucosa, galactosa y manosa (éste último en mayor proporción que losanteriores) para una EPS producido por Cordycepsmilitaris. 4.          ConclusionesLacaracterización molecular es esencialmente necesaria para dilucidar laspropiedades fisicoquímicas y bioactivas de los biopolímeros del tipo EPS yestablecer si existen relaciones estructura-función, lo que es un hecho muyfrecuente. Desarrollar metodologías de downstreamprocessing que permitan alcanzar buena eficiencia de recuperación y nivelesaceptables de purificación resulta fundamental para ahondar en estos estudios, ypermitirá ampliar las posibilidades de aplicación en diversas áreas una vezelucidadas sus propiedades físico-químicas.5.         BibliografíaKuo, Y.C.,Eum, W.J., Shiao, M.S., Chen, C.F. and Lin, C.Y. (1996). Cordyceps sinensis as an immunomodulatory agent. American Journal ofChinese Medicine 24, 111:125.Lee, J.,Chung, C., Jeong, H. and Lee, K. (1990) Anticomplementary and antitumoractivities of the alkali extract from the mycelia of Lentinus edodes IY 105. Korean Journal of Applied Microbiology andBiotechnology 18, 571: 577.Fariña, J. I., Sineriz,F., Molina, O. E., Perotti, N. I. (1998). High scleroglucan production by Sclerotium rolfsii: influence of mediumcomposition. BiotechnologyLetters, 20(9),825-831.Dubois M.,Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A. y Smith F. (1956). Colorimetric methodfor the determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry,28:350-356.Miller G.L.(1959). Use of dinitrosalycilic acid reagent for determination of reducingsugars. Analytical Chemistry, 31:426-428.Yu, R.,Yang, W., Song, L., Yan, C., Zhang, Z., & Zhao, Y. (2007). Structuralcharacterization and antioxidant activity of a polysaccharide from the fruitingbodies of cultured Cordyceps militaris.Carbohydrate Polymers, 70(4),430-436.6.         AgradecimientosPIP 0976, PIO-UNCa, PCBII CONICET-MINCyT-DFG