Micoproducción de L-DOPA

FARIÑA JI; PERALTA MP; LECHNER BE

Tucumán

Simposio; V Simposio Argentino de Bioprocesos SAPROBIO 2018; 2018

PROIMI-CONICET-UNT-EEAOC

Estainvestigación encara laproducción de L-Dopa (L-3,4 dihidroxifenilalanina), producto de labiotransformación de L-tirosina por acción de la enzima tirosinasa (TYR),utilizando un ascomiceto aislado de las Yungas Tucumanas, el cual fueseleccionado previamente, por ser productor de dicha enzima. Los ensayospreliminares se enfocaron en determinar las mejores condiciones de producciónen referencia al medio de cultivo y al inóculo utilizado. Se ensayaron dosmedios de cultivo descriptos en la literatura para la producción de L-Dopa, de loscuales se seleccionó el que permitió alcanzar mayor productividad. El medioseleccionado, un medio químicamente definido, contiene L-Tirosina, que sirve desustrato para la producción de L-Dopa. Se evaluaron diferentes concentracionesde este sustrato en vistas a aumentar la producción, encontrando que conconcentraciones mayores a 2 g/L el rendimiento no aumentaba. Así, se establecióesta concentración de sustrato como la indicada para estudios posteriores. Seguidamente,se procedió a analizar diferentes métodos de preparación del inóculo, evaluandohomogeneización con hand blender ycon Potter Elvehjem. La primera metodología permitió obtener buenaproductividad y reproducibilidad, no así en el segundo caso. El estudio de diferentesconcentraciones iniciales de inóculo permitió concluir que concentraciones deinóculo mayor al 10% (v/v) no producían un aumento en el rendimiento. Losresultados permitieron definir condiciones preliminares de cultivo (medio decultivo, concentración de sustrato, estrategia de inoculación y concentración inicialde inóculo) necesarias para alcanzar una buena producción de L-Dopa en condicionesde cultivo sumergido.Palabrasclaves: L-Dopa; Tirosinasas; Micoprospección.1.IntroducciónLaL-Dopa es el precursor de la dopamina y tiene amplias aplicacionesterapéuticas. La mayor parte de la L-Dopa que se vende comercialmente, sesintetiza a partir de vainillina e hidantoína, por un proceso químico que consisteen ocho etapas de reacción. La biotransformación de L-tirosina a L-Dopa puederealizarse mediante una reacción de oxidación catalizada por la enzima tirosinasa.Utilizando hongos productores de tirosinasas, es posible sintetizar L-Dopa encondiciones de cultivo sumergido, suspendiendo el micelio en una mezcla dereacción que contenga L-tirosina y condiciones optimizadas. La producciónbiotecnológica de L-Dopa puede ofrecer un proceso más eficiente respecto a lasíntesis química, ya que sólo consta de una etapa y el  producto que se obtiene es enantioméricamentepuro. El objetivo de este trabajo fue optimizar condiciones preliminares para producirL-Dopa en cultivo sumergido, utilizando un ascomiceto aislado de las YungasTucumanas.2.MetodologíaLacepa LY 38.7 (ascomiceto productor de tirosinasas) fue activada en medio CZMagar (7 d, a 25°C) y luego utilizada como inóculo para la producción de L-Dopaa escala Erlenmeyer, donde se evaluó diferentes medios de cultivo (Caldo PapaDextrosa (EPB) y Czapeck Dox, enriquecidos con L-Tirosina (ECB)). Así también,diferentes estrategias de homogeneización del inóculo (hand blender, Potter Elvehjem), concentraciones iniciales deinóculo (10%, 20%, 30% v/v) y concentraciones crecientes de L-Tirosina (1 a 5g/L, en incrementos de 1g/L) fueron ensayadas en Erlenmeyers de 250 mL con 50mL de medio Czapeck Dox, enriquecido con L-Tirosina (ECB), incubados durante 5d a 25°C y 200 rpm. Se incluyeron un control abiótico (en donde no se inoculócon la cepa LY 38.7) y un control biótico (en donde no se adicionó L-Tirosina),en idénticas condiciones. Los ensayos se llevaron a cabo por triplicado. Setomaron muestras periódicas, las cuales  se centrifugaron, y el sobrenadante se utilizópara determinar producción de L-Dopa y Actividad Tirosinasa (TYR), mientras quedel precipitado se cuantificó la biomasa (por peso seco). La producción deL-Dopa se midió por el método de Arnow y se determinó actividad tirosinasamonofenolasa y difenolasa.3.ResultadosTabla 1. Comparación de la Producción de L-DOPA en diferentescondicionesFuente: 2018 Peralta Maria Patricia4.DiscusiónLaproducción de L-Dopa se incrementó utilizando el medio ECB, y siendo que mostróvalores superiores a los reportados en el medio EPB, se utilizó este medio paracontinuar con los ensayos. El análisisestadístico reveló que no existe diferencia significativa en la producción deL-Dopa utilizando de 2 a 5 g/L de L-Tirosina, por lo tanto, 2 g/L se estableciócomo la concentración inicial óptima de sustrato, ya que concentracionessuperiores no tendrían un impacto positivo en términos económicos. En cuanto ala estrategia de inoculación, preparar los inóculos por homogeneización con hand blender resultó ser una técnica altamentereproducible, además de favorecer la producción de L-Dopa. Un inóculo al 10% (v/v)resultó ser adecuado para la producción de L-Dopa, no así valores superiores, yfue seleccionado como condición de partida para ensayos posteriores. No hubo producción de L-Dopa en ningún control,demostrando la actividad biotransformadora de la cepaproductora de tirosinasas sólo cuando hay tirosina disponible, y la estabilidaddel sustrato cuando no hay actividad biocatalítica.5.ConclusionesEl medioECB es un medio químicamente definido, lo que representa una ventaja a futuroal momento de purificar la L-Dopa producida. El mejor rendimiento se obtuvoutilizando 2 g/L de L-tirosina, lo que podría relacionarse a que un incremento enla concentración inicial de L-Tirosina por encima de 2g/L sólo saturaría elsistema. La metodología de preparación del inóculo así como su concentración aliniciar el cultivo resultan críticas para alcanzar resultados competitivos yreproducibles. Puesto que menores concentraciones de inóculo se asociaron a menorcrecimiento y mayor producción de L-Dopa, podría presumirse que la producción requierecierto control sobre la generación de biomasa. En cuanto a la dinámica de producción de L-Dopa, estadepende necesariamente de la adición de L-Tirosina al medio de cultivo, y requierede la actividad metabólica especializada de un organismo seleccionado como esel caso de la cepa LY 38.7, bajo condiciones de cultivo optimizadas.6. BibliografíaKrishnaveni, R., Rathod, V., Thakur, M. S., &Neelgund, Y. F. (2009). Transformation of L-tyrosine to L-dopa by a novelfungus, Acremonium rutilum, undersubmerged fermentation. Current Microbiology, 58 (2), 122-8.7.AgradecimientosPIP 0407, PIP 0976,PIO-UNCa