Levaduras hiperproductoras de etanol: aislamiento, selección, identificación y estudio del estrés oxidativo

MURUAGA ML; PEROTTI NI; ABATE CM

Mar del Plata

Congreso; VI Congreso Argentino de Ingeniería Química (CAIQ); 2010

Asociación Argentina de Ingenieros Químicos

Introducción: Los combustibles fósiles, el petróleo y sus derivados, como fuente de energía no renovable, están presentando señales de agotamiento. Se estima que a mediano plazo ya no será posible cubrir la demanda mundial y se espera un fuerte aumento en los precios, esta situación sumada a la contaminación ambiental y al calentamiento global, provocados principalmente por el uso desmedido de este tipo de combustibles, ha generado la necesidad de profundizar estudios que tornen viables la utilización a gran escala de nuevas fuentes energéticas. El uso de bioetanol produce una disminución en el impacto ambiental al reducir los valores de contaminación ya que tiene un índice de octano superior y una presión de vapor inferior al de la gasolina resultando en menores emisiones evaporativas. En Tucumán se encuentran funcionando numerosos ingenios azucareros cuya molienda anual alcanza las 15 millones de toneladas de caña con un rendimiento de azúcar del 11%. La entrada en vigencia de la Ley 26.093 de Biocombustibles en Argentina a partir de 2010 significará la oportunidad para el sector azucarero de ampliar la producción de etanol para abastecer con el 5% del mismo a la  totalidad de las naftas. Un abordaje microbiológico, propone utilizar cepas de microorganismos fermentativos de alta tolerancia a alcohol con el propósito de aumentar concentración de etanol de 11% que se obtiene actualmente, por la fermentación alcohólica de melazas. Por ello es necesario el aislamiento e identificación de cepas de levaduras hiperproductoras de etanol a partir de melazas de caña de azúcar. Materiales y Métodos: Para llevar a cabo los aislamientos de levaduras, se tomaron muestras de melazas de distintos ingenios tucumanos y se usaron medios YPD e YPS con antibióticos. Para la propagación de los microorganismos se utilizó medio YPS con 50g/L de sacarosa incubando en baño termostatizado a 30ºC con agitación. Las fermentaciones se realizaron por duplicado en frascos con 200 mL de medio YPS de 250 g/L de sacarosa que fueron incubados en estufa a 30 ºC. Se tomaron muestras cada 8 h y se determinó ART, ARD, peso seco y concentración de etanol. Las levaduras seleccionadas fueron identificadas mediante taxonomia molecular, para lo cual se realizaron reacciones de PCR utilizando primers universales flanqueantes a las regiones correspondientes a los espaciadores intergénicos D1 y D2 del gen que codifica para el ARNr 28S. Los productos de amplificación fueron secuenciados y las secuencias obtenidas fueron comparadas con las presentes en Bancos de Datos Públicos. Para el estudio de estrés oxidativo se llevó acabo la extracción de las enzimas para lo cual se preparó un homogenato o extracto de células con agitación vigorosa con perlas (1 ml de células y un volumen equivalente a 0,5 ml de perlas), en buffer fosfato pH = 7,8 en microtubos de 2 ml. Se realizaron diez pulsos de 1’ en vortex, con intervalos entre los pulsos de 1’ en baño de hielo. Posteriormente el homogenato fue centrifugado a 10.000 g, 20’ a 4 ºC y al sobrenadante se lo almacenó a -20 ºC hasta su uso. Se trabajó con células fermentadas (condiciones anaeróbicas) durante 24, 48 y 72 h y con una muestra correspondiente a la propagación que se utilizó como inóculo inicial (condiciones aeróbicas). La actividad SOD se determinó de acuerdo a la técnica de Beauchamp y Fridovich (1971), que se basa en la capacidad de SOD de inhibir la reducción de la sal de nitroblue tetrazolium (NBT) a formazan, de color violeta, reacción que se produce por un flujo fotoquímico de O2. La actividad catalasa se evaluó determinando la disminución de H2O2 por espectrofotometría a 240 nm y por unidad de tiempo. Resultados y Conclusión: Se obtuvieron 30 aislamientos de los cuales 23 de los mismos produjeron una concentración de alcohol menor del 5% de etanol, en los restantes 7 aislamientos se obtuvieron concentraciones de etanol que oscilaron entre 5 y 13% siendo las más elevadas A2, A10 y A11 que produjeron 11,74; 12,81 y 13,20% de etanol respectivamente. El análisis de las secuencias obtenidas permitió asignar una identidad del 99 y 100% con Saccharomyces cerevisiae. Se observó una baja concentración de la enzima  SOD en las primeras muestras de cada cepa (propagación, 8, 12, 24h) la cual disminuye en las muestras posteriores hasta hacerse 0 a las 24 y 48 h de fermentación en condiciones de anaerobiosis. Ninguna de las muestras presentó actividad catalasa.             Estos resultados nos indicarían que las levaduras seleccionadas no están sometidas a un estrés oxidativo que podría afectar su rendimiento para la producción de etanol y verificamos que pueden ser cepas confiables para uso industrial como alternativa para la elaboración de un combustible alternativo como es el bioetanol. Los mejores resultados, obtenidos con las cepas A10 y A11, justifican posteriores estudios que conduzcan a una optimización en la producción de etanol con el consecuente ahorro energético que ello significa.