Clonado y expresión de dos diglicosidasas de interés biotecnológico

NEHER B; MAZZAFERRO LS; WEIZ G; BRAUN LE; OYHENART J; KOTIK M; KREN V; BRECCIA JD

Santa Fe

Simposio; 3er Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos; 2014

CLONADO Y EXPRESIÓN DE DOS DIGLICOSIDASAS DE INTERÉS BIOTECNOLÓGICO Neher Bárbara D.; Mazzaferro Laura S.; Weiz Gisela; Braun Lucas E.; Oyhenart Jorge, Kotik Michael; Kren Vladimir y Breccia Javier D. INCITAP-CONICET, Departamento de Química, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad Nacional de La Pampa (UNLPam), Av. Uruguay 151, (6300) Santa Rosa, La Pampa, Argentina. Institute of Microbiology Academy of Sciences Czech Republic. Praga, República Checa. barbaraneher@hotmail.com Introducción: Hesperidina (hesperetina 7-O-α-ramnopiranosil-β-glucopiranosido) es abundante en los frutos cítricos y contribuye a la opacidad y sabor agrio de los jugos. La hidrólisis enzimática con monoglicosidasas se ha empleado para reducir el sabor amargo y para clarificar estos productos. Las diglicosidasas permiten completar la desglicosilación en un solo paso independientemente de las concentraciones diferenciales de los sistemas multienzimáticos. Por otro lado, las diglicosidasas capaces de transglicosilar azúcares son herramientas prometedoras para la síntesis de glicósidos bioactivos a medida. El objetivo de este trabajo fue clonar y expresar dos diglicosidasas capaces de remover la fracción sacarídica del flavonoide hesperidina y una de ellas capaz de trasglicosilar el disacárido sobre aceptores con oxidrilos primarios, secundarios y fenólicos. El origen de estas enzimas fueron la bacteria Actinoplanes sp. SES612 y el hongo Acremonium sp. DSM24697. Metodología: expresión de la diglicosidasa bacteriana en Escherichia coli BL21-pET 100 TOPOvector. Purificación por cromatografía de afinidad a metales (IMAC) desde el citosol bacteriano. La expresión de 6-O-α-ramnosil-β-glucosidasa fúngica fue realizada en dos sistemas: E. coli BL21 codon plus-pET 101 TOPOvector y el sistema eucariota Pichia pastoris-pPICZα. La actividad hidrolítica se determinó por la liberación de azúcares reductores. Los productos de reacción fueron analizados por TLC, NMR. La desglicosilación de las proteínas eucariotas fue realizada por Endoglicosidasa H (Endo H) y Péptido-N-Glicosidasa F (PNGasa F). Resultados: la enzima recombinante de Actinoplanes presentó actividad frente a los sustratos artificiales 4-metilumbeliferil-rutinosido (4-MUR), p-nitrofenil-α-L-rutinósido (pNR) y el sustrato natural hesperidina, pero no sobre el sustrato rutina. La actividad específica fue igual a la actividad de la proteína wild type (2,23 U/mg). La actividad decrece hasta un 50% luego de 2 ciclos de congelado y descongelado (-20°C, 24h) y respecto a la estabilidad en almacenamiento a 8°C esta perdió 40% de la actividad luego de 10 días. La 6-O-α-ramnosil-β-glucosidasa de Acremonium fue expresada en E. coli y en P. pastoris. Ambas exhibieron actividad hidrolítica frente a los sustratos artificiales 4-metilumbeliferil-rutinosido (4-MUR), p-nitrofenil-α-L-rutinósido (pNR) y el sustrato natural hesperidina. La actividad específica de la proteína recombinante de P. pastoris (4,97 U/mg) fue 4 veces mayor que la de la proteína wild type (1,25 U/mg). La capacidad de transglicosilación no pudo ser detectada con la proteína expresada en el sistema procariota, mientras que la recombiante eucariota presentó esta actividad al igual que la enzima wild type. Considerando que la proteína wild type es una glicoproteína, este resultado podría ser explicado por la no glicosilación de la proteína expresada en el sistema procariota. Por tal motivo, se evaluó si la desglicosilación enzimática de la proteína afectaba la actividad de transglicosilación. La desglicosilación fue significativa con Endo H mientras que la enzima tratada con PNGasa F no mostró diferencias de peso molecular respecto de la parental. No obstante en ninguno de los 2 tratamientos fue afectada la actividad de tranglicosilación o hidrolítica. Conclusiones: Se logró la expresión funcional de la diglicosidasa de origen procariota (Actinoplanes sp. SES612). Este sistema permite mayor producción en menor tiempo, con medios de cultivos más económicos y una purificación más sencilla. La expresión de la 6-O-α-ramnosil-β-glucosidasa del hongo Acremonium sp. DSM24697 se logró en ambos sistemas E.coli y P. pastoris. En el sistema procariota la enzima recombinante no mostró capacidad para transglicosilar, mientras que la producida por la levadura exhibió ambas actividades al igual que la proteína original. La desglicosilación enzimática de las proteínas eucariotas no afectó la actividad de transglicosilación, por lo tanto no se pudo demostrar si el péptido no glicosilado producido por E. coli era la causal de esta diferencia. Es posible que la desglicosilación enzimática no haya sido efectiva dado que se realizó sobre la proteína nativo o podría ser que la fracción glicosídica es imprescindible durante el plegado del péptido para la actividad de transglicosilación.