INVESTIGADORES
MUGLIA Cecilia Isabel
congresos y reuniones científicas
Título:
Evaluación del clivaje de la citoqueratina 18 presente en células de cultivo infectadas con Herpesvirus equino 1 (EHV-1) e inducidas a la muerte por apoptosis.
Autor/es:
SCROCHI, M.; ZANUZZI, C.; FUENTEALBA, N.; MUGLIA, C. I; GIMENO, E.; BARBEITO, C.; PORTIANSKY, E.; GALOSI, C.
Reunión:
Congreso; XXXII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología; 2012
Resumen:
El EHV-1 es un agente infeccioso que produce signos respiratorios, nerviosos, muerte embrionaria, abortos y síndrome neonatal en equinos. La respuesta inmune a la infección es de corta duración y, al igual que el resto de los herpesvirus, el EHV-1 desarrolla distintos mecanismos para evadirla. Entre otros, el virus evita que las células infectadas mueran por apoptosis, lo que le permite subsistir y replicarse dentro de ellas. La citoqueratina 18 es una de las proteínas citoplasmáticas blanco de las caspasas efectoras cuando se desencadena el proceso de apoptosis. Hasta el momento, no se han determinado los mecanismos por los cuales el EHV-1 interfiere con la apoptosis y sólo un estudio demuestra la capacidad de inhibir este proceso en cultivos neuronales. El objetivo de este trabajo fue determinar el índice de clivaje de la citoqueratina 18 presente en células de cultivo infectadas con el EHV-1, en diferentes tiempos posinfección (pi), mediante técnicas de inmunofluorescencia. Se utilizaron células MDBK desarrolladas sobre cubreobjetos con MEM-10% SFB. En la primeras 48 h, la monocapa fue infectada con EHV-1 (MOI10) e incubada con MEM-1% SFB. A las 3, 6, 9, 12, 15 y 18 h pi se indujo la apoptosis mediante el agregado de sorbitol 1M (concentración previamente determinada mediante medición de fragmentación de ADN en gel de agarosa) durante 1 h. Las células fueron reincubadas durante 1 h con MEM-1% SFB y posteriormente levantadas y fijadas con acetona fría. Para cada uno de los tiempos analizados se realizaron controles de infección, de apoptosis y sin infección ni inducción (mock). Las células se incubaron con el anticuerpo M30 CytoDEATH (Roche), específico para el sitio de clivaje de la citoqueratina 18 producido por las caspasas efectoras y con un anticuerpo anti-ratón conjugado con el fluorocromo Alexa 488. Finalmente, fueron incubadas con DAPI (4´,6-diamidino-2-fenilindol) para identificar los núcleos celulares. Los resultados fueron observados a través de un microscopio confocal y cuantificados mediante un analizador de imágenes. El mayor porcentaje de apoptosis celular en el grupo mock, se observó a las 9 h. En el control de infección se detectó marcación a las 9, 15 y 18 h pi, siendo el mayor porcentaje a las 18 h pi. El control de apoptosis mostró un incremento gradual del porcentaje de marcación positiva, aunque los valores observados a las 18 h pi fueron menores que en el control de infección. En las células infectadas e inducidas no se detectó marcación positiva a las 9 h pi pero en los restantes puntos horarios se notó un incremento gradual de la apoptosis, aunque menor que en el control de infección. Podemos concluir que la infección por EHV-1 estaría retrasando la apoptosis de las células infectadas durante la primera etapa del ciclo de replicación viral (9 h) y, en menor medida, hacia el final del mismo (18 h), lo que podría entonces estar relacionado a la transcripción viral de los genes tempranos.