Desarrollo de una técnica de RT-Nested-PCR para la detección del virus de la Encefalitis de San Luis (ESL)

RE, VIVIANA; SPINSANTI, L; DIAZ LA; FARIAS A; AGUILAR J; TENORIO A; CONTIGIANI M

CABA, Buenos Aires, Argentina

Congreso; VIII Congreso Argentino de Virología; 2005

Sociedad Argentina de Virologia

DESARROLLO DE UNA TÉCNICA DE RT-NESTED PCR PARA LA DETECCIÓN DEL VIRUS DE LA ENCEFALITIS DE SAN LUIS (ESL) RE, VIVIANA ; SPINSANTI, LORENA; DIAZ, ADRIAN; FARIAS, ADRIAN; AGUILAR, JAVIER; TENORIO*, ANTONIO; CONTIGIANI, MARTA Instituto de Virología, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Córdoba - RED CYTED. Virología Clínica / Clinical Virology Servicio de Microbiología Diagnóstica, Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda, Madrid, España.RED CYTED El virus de la encefalitis de San Luis (ESL) es un arbovirus del género Flavivirus, cuyo ciclo de mantenimiento y amplificación involucra huéspedes vertebrados y mosquitos del género Culex, como vectores. Se encuentra ampliamente distribuido en Argentina. Recientemente en Córdoba se demostró seroconversión para este virus en pacientes con síndromes neurológicos, durante un brote de encefalitis por Flavivirus ocurrido en el verano-otoño del año 2005. Los métodos serológicos son generalmente los que se aplican para el diagnóstico del virus ESL, aunque su interpretación es difícil por las reacciones cruzadas que ocurren con otros Flavivirus que circulan en nuestro país (Dengue, Ilheus, Bussuquara). Así mismo, el aislamiento del virus tiene baja eficiencia por ser la viremia baja, de corta duración en humanos y requerir condiciones de esterilidad, refrigeración y equipamiento con nivel de bioseguridad para el manejo de las muestras. Por lo tanto, es necesario disponer de técnicas moleculares rápidas, sensibles y específicas, que contemplen características antigénicas y genéticas de los virus que circulan en la región y que se adecuen a las posibilidades de nuestro país. El objetivo del presente trabajo fue desarrollar y evaluar una técnica de RT – nested PCR para la detección específica del virus ESL, a ser aplicada en el diagnóstico clínico y la vigilancia de esta patología. Se incluyeron, seis cepas del virus ESL (Saint Louis 1933 Parton, BeH356964, SPAN11916, AN9275, AN9124 y 78V6507) y cepas de los Flavivirus: Fiebre amarilla cepa 17D (vacunal) , Ilheus H 7445, Dengue 2 cepa New Guinea y Bussuquara AN4116. Se utilizó como fuente de virus, células Vero infectadas con cada una de las cepas en estudio, cosechadas entre el 4 – 5 días con efecto citopático evidente. El ARN viral se extrajo con el reactivo TRIZOL y se procedió a la síntesis de ADNc mediante transcripción reversa usando random hexámeros primers. Los primers utilizados para la amplificación del ADN fueron diseñados sobre la base de la secuencia total del aislamiento ESL-M16614, obtenida del GenBank. Se seleccionaron los primers degenerados 574 (+:5’ 1497rryatgggygagtatggracag1518 3’) y 1573 (-: 5’ 2496ctcctccacayttyarttcacg2517 3’), utilizados en la primera amplificación para amplificar parcialmente la región NS1 y parte de la envoltura del genoma del virus ESL, y los primers 1079 (+:5’2002tggaytggacrccggttggaag20233’) y 1313 (-: 5’ 2236ccaatrgatccraartcccacg22573’) utilizados en la nested PCR para amplificar una porción de la envoltura del genoma viral. Todas las cepas de ESL analizadas en este estudio resultaron correctamente amplificadas, obteniendo productos del tamaño esperado (1020pb en la RT-PCR y 255pb en la nested PCR). No se observaron bandas de amplificación cuando se analizaron las células no infectadas y los otros Flavivirus incluidos en el ensayo, resultando una técnica específica. La sensibilidad de la reacción se determinó usando ARN extraído de diluciones seriadas factor 10 de un stock de virus ESL, cepa 78V6507, con 9,3 x 108 ufp/ 0.1ml. Se obtuvieron bandas del tamaño esperado hasta las diluciones 10-4 y 10-8, las cuales correspondieron a un límite de detección de 93.000 y 9,3 ufp/ 0,1ml para la RT-PCR y nested PCR, respectivamente. La técnica desarrollada resultó ser sensible, rápida y confiable para la detección de ESL y su futura aplicación permitirá, mejorar el diagnóstico clínico y contribuir a la ejecución mas efectiva de la vigilancia virológica de este Flavivirus de importancia médica, endémico en la región, así como también permitirá conocer las variaciones genéticas de las cepas circulantes y su influencia en la epidemiología, virulencia y características biológicas.