Extracción líquido-líquido de la proteasa ácida secretada por la levadura antártica Rhodotorula mucilaginosa L7 mediante sistemas bifásicos acuosos biocompatibles

LUCIANA D. LARIO; LUCIANA PELLEGRINI MALPIEDI; JORGE F.B. PEREIRA ; LARA DURÃES SETTE; ADALBERTO PESSOA JR

Santa Fe

Simposio; 3º Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos; 2014

Las proteasas representan uno de los tres mayores grupos de enzimas industriales, por lo cual el aislamiento y purificación en gran escala de estas enzimas requiere metodologías eficientes que permitan preservar sus propiedades biológicas a un costo relativamente bajo. Entre los distintos grupos de organismos utilizados industrialmente para la producción de enzimas, los microorganismos adaptados al frio han sido recientemente foco de interés, debido a que las enzimas que estos producen presentan una mayor eficiencia catalítica a temperaturas bajas y moderadas, lo cual resulta muy útil para la disminución de los costos industriales usualmente asociados a los procesos de calentamiento. Además, debido a que estas enzimas son termosensibles, pueden ser rápidamente inactivadas, lo cual es útil en muchas aplicaciones biotecnológicas que requieran una rápida velocidad de inactivación a temperaturas relativamente bajas. En estudios previos, hemos seleccionado, entre un grupo de 100 levaduras antárticas, a la levadura R. mucilaginosa L7 como la mayor productora de proteasas. Por lo tanto, con el objetivo de purificar esta enzima de interés mediante un proceso de bajo costo y utilizando metodologías ecológicamente viables, se procedió a la optimización de extracción de dicha proteasa mediante sistemas bifásicos acuosos PEG/sal.Condiciones de cultivo: La levadura en estudio (cepa L7) fue previamente aislada de algas marinas de la Antártida, e identificada como Rhodoturola mucilaginosa L7. Para la producción de la proteasa, se realizaron cultivos de dicha levadura en medio Saboraud- dextrosa, a 25 ºC y 150 rpm durante 48 h. El sobrenadante libre de células, que presentó una actividad proteolítica de 200 U/ml, fue almacenado en ultrafreezer a -70 ºC para ser utilizado en los experimentos de partición. Evaluación de la estabilidad de la enzima en presencia de PEG y sales: La estabilidad de la proteasa fue evaluada incubando la enzima en presencia de distintas concentraciones de PEG-2000, PEG-4000, PEG-6000, tartrato de sodio y citrato de sodio, a 20ºC, durante 0 a 3 h, y posteriormente se determinó la actividad proteolítica residual en las condiciones óptimas de la enzima (50 ºC, pH 5.0).Partición de la proteasa en los sistemas bifásicos acuosos: Los sistemas PEG/citrato de sodio y PEG/tartrato de sodio fueron preparados de acuerdo a los diagramas de fase previamente reportados. Todos los compuestos de la mezcla ternaria fueron adicionados a tubos de 15 ml pesando las respectivas soluciones, y luego mezclando los mismos hasta obtener una completa homogeneización. Posteriormente, los tubos fueron mantenidos a la temperatura de interés (4, 17, y 30 ºC) hasta alcanzar la completa separación de fases (al menos 1 h). A continuación, los volúmenes de la fase superior e inferior fueron medidos y en cada fase se realizó la cuantificación de la actividad proteolítica, y de la concentración de proteínas totales, de acuerdo a los protocolos descriptos por Charney y Tomarelli, y por Smith et al., respectivamente. Diseño experimental: Se realizaron dos diseños experimentales, uno para el sistema PEG/tartrato y otro para el sistema PEG/citrato. En ambos casos, las variables independientes analizadas fueron: peso molecular de PEG (X1), concentración de PEG (X2) y temperatura (X3), mientras que las variables respuesta analizadas fueron: coeficiente de partición de la enzima (Ke) (Y1), factor de purificación (FP) (Y2), y rendimiento en la fase superior (R %) (Y3). Los resultados fueron analizados con el software Statistica versión 10 (StatSoft, Tulsa, OK, USA).Efecto de las sales y PEG en la estabilidad de la enzima: Antes de realizar los análisis de partición de la enzima, se procedió a analizar su estabilidad en presencia de los reactivos utilizados para realizar los sistemas bifásicos acuosos (SBA). Los resultados obtenidos demostraron una disminución gradual de la estabilidad de la proteasa con el aumento de la concentración de sales, siendo la mayor disminución observada luego de 3 h de incubación con tartrato de sodio 18 % (p/p) o citrato de sodio de igual concentración (la actividad proteasa residual fue del 80% y 75%, respectivamente). Por otra parte, la presencia de PEG de diferentes pesos moleculares no afectó la estabilidad de la proteasa, a pesar de las altas concentraciones de polímero utilizadas (32% p/p). Partición de la proteasa en los SBA: De acuerdo a los resultados obtenidos en los análisis de estabilidad, se decidió trabajar con la concentración mínima de sales posibles que permitan la formación de los SBA propuestos (PEG/citrato de sodio y PEG/tartrato de sodio). Para ambos sistemas, se analizó la influencia del peso molecular y concentración de PEG, como también de la temperatura, en la partición de la enzima. En ambos sistemas, la proteasa particionó preferencialmente hacia la fase superior rica en PEG (Ke>1). Además, los parámetros FP y R% alcanzados para el sistema PEG/tartrato fueron mayores que para el sistema PEG/citrato, obteniendo un R% del 81.09 y un FP de 2.51, al utilizar PEG-6000 a la menor concentración posible (13% p/p). En este trabajo se evaluó la potencial aplicación de los SBA para la purificación de la proteasa secretada por la levadura adaptada al frio R. mucilaginosa L7. En primer lugar, se encontró que la enzima fue completamente estable en las diferentes soluciones de PEG, como también en presencia de tartrato de sodio y citrato de sodio a bajas concentraciones (menores al 18% p/p). Por otra parte, las mejores condiciones para la purificación de la proteasa (Y% de 81.09 y FP de 2.51) fueron obtenidas en el sistema compuesto por PEG-6000 y tartrato de sodio a 30 ºC, siendo comprobada, mediante análisis estadístico, una fuerte influencia del peso molecular y la concentración de PEG en la partición de la enzima. Teniendo en cuenta estos resultados, así como el carácter biocompatible y biodegradable del sistema PEG/tartrato, este análisis demuestra que dicha metodología es útil para purificar proteasas para propósitos industriales a bajo costo.