OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES SEPARATIVAS DE TRIPSINÓGENO Y QUIMOTRIPSINÓGENO EN SISTEMAS BIFÁSICOS ACUOSOS

LUCIANA PELLEGRINI MALPIEDI; BIBIANA NERLI; GUILLERMO A. PICO

Rosario

Congreso; Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2006

Sociedad de Biología de Rosario

>En trabajos previos estudiamos el perfil de reparto de tripsinógeno (TRPz) y quimotripsinógeno (QTRP) en sistemas bifásicos acuosos (SBAs) formados por polietilenglicol (PEG) y citrato de sodio (NaCit). El SBA formado por PEG de peso molecular 1450 y NaCit pH 8,2 demostró tener propiedades adecuadas para ser potencialmente aplicable a la separación de ambos zimógenos. En el presente trabajo se buscó optimizar el proceso separativo mediante la manipulación de variables tales como el número de pasos extractivos y relación de volúmenes de fase con la finalidad de aplicar los resultados a la purificación de tripsina, forma enzimáticamente activa, de alto valor comercial, a partir de páncreas bovino. Se repartieron mezclas de TRPz y QTRPz en SBAs PEG1450/NaCit pH 8,2 con dos composiciones correspondientes a dos líneas de unión diferentes del respectivo diagrama binodial. Se ensayaron distintas relaciones de volumen de fase. Se agregó un segundo paso extractivo reemplazando la fase superior del primer reparto por igual volumen de dicha fase limpia. La cuantificación de TRPz en ambas fases fue realizada por un método específico que comprende dos etapas: i) la activación cuantitativa del TRPz a tripsina y ii) la determinación de la actividad enzimática de la tripsina formada mediante sustrato cromogénico. El incremento de la relación de volúmenes de fase, R = Vsuperior/Vinferior), desde 1 a 4 incrementó los valores de pureza del TRPz obtenido en la fase inferior desde 66 a 84 %. La estrategia de aumentar el número de extracciones mostró ser más eficaz para obtener una proteína con alto grado de pureza alcanzándose valores de hasta 92 %. Ambas alternativas fueron acompañadas por una significativa pérdida de rendimiento (desde 56 al 34 %), que en nuestro caso no representa una desventaja seria, ya que el páncreas bovino, potencial fuente de obtención de la enzima, es un abundante subproducto de desecho, prácticamente sin costo de la industria frigorífica local. Finalmente, los sistemas no tradicionales formados por polietilenglicol y citrato de sodio, a diferencia de otros SBAs PEG/sal no impactarían en el medioambiente por la biodegradabilidad del anión citrato Esta ventaja sumada a los altos valores de pureza obtenidos y la facilidad del escalado permitiría que estos sistemas puedan formar parte en un futuro de protocolos de purificación industrial.