PURIFICACIÓN DE TRIPSINÓGENO Y QUIMOTRIPSINÓGENO A PARTIR DE PÁNCREAS BOVINO MEDIANTE EXTRACCIÓN CON SISTEMAS BIFÁSICOS ACUOSOS DE BAJO IMPACTO

PELLEGRINI MALPIEDI, LUCIANA; PICÓ, GUILLERMO; NERLI, BIBIANA

Rosario

Simposio; 1er Simposio Argentino de los Procesos Biotecnológicos; 2010

Laboratorio de Fisicoquímica Aplicada a Bioseparación . Rosario.

Introdución: En los  últimos años, la problemática bio-separativa ha cobrado relevancia debido a la creciente necesidad de disponer de grandes cantidades de enzimas en diferentes procesos productivos. El costo final de una bio-molécula empleada a nivel industrial depende de su grado de pureza y está determinado mayoritariamente por la etapa de aislamiento a partir de su fuente. Surge así, un interés por desarrollar métodos separativos que sean eficientes, relativamente económicos y que puedan ser aplicados a macro-escala. A partir de los 60's, ha adquirido marcado interés una metodología separativa que emplea polímeros de cadena flexible (PCFs): la extracción líquido-líquido con sistemas bifásicos acuosos (SBAs). Inicialmente se utilizaron SBAs formados por un polímero como el polietilenglicol (PEG) y una sal de fosfato, pero las altas concentraciones de sal requeridas y su no biodegradabilidad los hace perjudiciales para el medio ambiente. Es por esto, que resulta de sumo interés evaluar las propiedades bioseparativas de nuevos SBAs formados por un polímero y una sal de anión biodegradable. Las proteínas en estudio, tripsinógeno (TRPz) y quimotripsinógeno (QTRPz), son los precursores de tripsina y quimotripsina, dos enzimas que poseen una amplia gama de aplicaciones en la fabricación de alimentos, ablandamiento de cueros y producción de vacunas, entre otras. Metodología: Se determinó el patrón de reparto de TRPz y QTRPz en SBAs, caracterizados previamente en nuestro laboratorio, formados por polietilenglicoles (PEGs) de diferentes pesos moleculares (600, 2000, 4000 y 6000) y tartrato de sodio (NaTart) pH 5,00.  Luego de sembrar pequeñas alícuotas de TRPz y QTRPz, los SBAs seleccionados se mezclaron y dejaron reposar hasta alcanzar el equilibrio de reparto. Estimado el contenido proteico en cada fase por medidas de absorbancia a 280 nm, el coeficiente de reparto, Kr, fue calculado como el cociente de dichas absorbancias. Se evaluó el efecto de diferentes variables del sistema sobre el valor de Kr: longitud de la línea de unión, agregado de sales inertes, y cociente de volúmenes de fase. Aquellos SBAs que evidenciaron mayor capacidad de recuperar TRPz, QTRPz o una mezcla de ambos zimógenos fueron seleccionados en un paso ulterior para ensayar el reparto de homogenado pancreático. En este caso la masa límite de homogenado sembrada sobre los SBAs fue hasta un 20% de la masa total del sistema. El seguimiento del proceso extractivo se realizó a través del cálculo de los valores de rendimiento (R) y el factor de purificación (FP). El contenido de TRPz y QTRPz fue determinado mediante medidas de la actividad enzimática de sus respectivas formas activas frente a sustratos cromogénicos específicos, luego de un paso previo de activación de los precursores. La pureza de los distintos extractos también fue evaluada mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes. Resultados: En la mayoría de los sistemas ensayados se observó que QTRPz presenta valores de Kr mayores a los de TRPz, comportamiento semejante al observado anteriormente para SBAs formados por PEG y citrato de sodio. Los SBAs formados por PEG600 mostraron capacidad de recuperar más del 82 % de ambos zimógenos en la fase rica en polímero, mientras que aquellos formados por PEG6000 hicieron lo propio en la fase rica en sal. Los SBAs formados por PEG2000 evidenciaron la mayor selectividad respecto de TRPz y QTRPz. El reparto de homogenado pancreático sobre los SBAs seleccionados mostró como característica común la aparición de un precipitado compacto a nivel de la interfase, correspondiente a restos celulares y membranas provenientes de la disrupción celular. Esto sugiere que el clarificado se lleva a cabo junto con la distribución entre fases en una única etapa, lo cual representa una ventaja operativa. El balance de masas realizado en cada sistema  permitió demostrar la coprecipitación inferfacial de una fracción de las proteínas de interés en algunos casos. Los sistemas formados por PEG600 y PEG4000 resultaron los más adecuados para emplear en una estrategia de purificación con valores de R superiores al 70 % y FP cercanos a 3 para ambos zimógenos. El cambio en el cociente de volúmenes de fase en el rango 0,5 - 4 no mejoró los parámetros de purificación de estos sistemas. El análisis cuantitativo de las bandas obtenidas en la electroforesis en gel de poliacrilamida –en medio desnaturalizante- arrojó valores de R y FP similares a los obtenidos por medidas de actividad, sugiriendo que durante el proceso no hay pérdida en la actividad de las proteínas de interés. Sobre la fase superior del SBA PEG600/NaTart, proveniente del primer paso extractivo, se adicionaron cantidades adecuadas de PEG8000 y tartrato de sodio de modo de originar un nuevo SBA. Esto permitió recuperar una mezcla casi exclusiva (95%) de TRPz y QTRPz en la fase inferior, rica en sal y pobre en contenido de polímero (3 %). Conclusiones: Los resultados obtenidos indican que los SBAs formados por polietilenglicol y tartrato de sodio pH 5,00 son potencialmente aplicables en la extracción de tripsinógeno y quimotripsinógeno a partir de páncreas bovino. Particularmente, el SBA formado por PEG600 permite, sin la necesidad de un paso de clarificado previo, recuperar una mezcla mayoritaria de ambos zimógenos (95 %) en la fase superior del sistema, rica en polímero, siendo que los componentes de mayor tamaño o resto celulares del homogenado se desplazan hacia la fase inferior o precipitan en la interfase. En un paso posterior, el agregado de cantidades adecuadas de PEG8000 y tartrato de sodio, permite realizar una retroextracción de ambos zimógenos obteniendo un extracto con bajo contenido polimérico (3 %) y evitando con esto recurrir a  procesos de ultrafiltración o exclusión molecular. Teniendo en cuenta la simplicidad de esta metodología, su bajo impacto y fácil escalado, resulta posible prever su potencial inclusión en un protocolo de purificación a nivel industrial.