INVESTIGADORES
NERLI Bibiana Beatriz
congresos y reuniones científicas
Título:
Aplicación de Sistemas Bifásicos Acuosos (SBA) para el aislamiento de toxinas ofídicas
Autor/es:
GOMEZ, GABRIELA; NERLI BIBIANA; ACOSTA, OFELIA; PICÓ, GUILLERMO; LEIVA, LAURA
Lugar:
Resistencia, Chaco
Reunión:
Jornada; Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2006 - UNNE; 2006
Institución organizadora:
Secretaria General de Ciencia y Tecnica - UNNE
Resumen:
Los venenos de serpientes vienen siendo estudiados desde hace varias décadas, no sólo en sus efectos tóxicos producidos por el veneno entero, sino también a través del aislamiento de sus componentes, generalmente enzimas capaces de afectar la estructura de biomoléculas ó mecanismos fisiológicos que se presentan en el individuo accidentado. En la actualidad, ha crecido el interés farmacológico de emplear tales componentes como potenciales antibióticos, antitumorales, en el tratamiento de desórdenes en la hemostasia, como así también su uso como reactivos analíticos. La metodología vigente para su aislamiento y purificación es la cromatografía en columna. Sin embargo estas técnicas son costosas, y cuando la purificación exige trabajar a mayores presiones, a través de equipos de HPLC y FPLC, la cantidad de muestra factible de procesar es muy baja. La necesidad de disponer de proteínas para uso farmacológico, analítico o alimenticio en grandes cantidades y con elevado grado de pureza ha llevado al desarrollo de metodologías de aislamiento y purificación más simples, económicas y que puedan emplearse a gran escala. Así, la biotecnología de aislamiento de proteínas, mediante reparto en sistemas bifásicos acuosos resulta una opción con potencial aplicación en venenos ofídicos. En este trabajo se aplicó con éxito el sistema bifásico acuoso PEG (3350)-Fosfato, para el aislamiento de una enzima acídica con actividad fosfolipasa, componente que, junto a las proteasas, es el principalmente responsable de la intoxicación por veneno de Bothrops alternatus (yarará de la cruz ó yarará grande), especie que causa el mayor número de accidentes en la región nordeste de Argentina. El SBA se preparó por gravimetría (12,3 – 13,7 - 74 %w/w de fosfato, PEG3300 y agua respectivamente) obteniéndose dos fases acuosas (TOP, superior , y BOTTOM, inferior). La adición del veneno y posterior agitación, permitió el reparto de sus componentes en ambas fases. Se testeó la actividad de las distintas enzimas (proteolítica, hemolítica y coagulante) en la fase inferior final, y en cada una de las renovaciones de fase TOP que se practicaron (tres). Fue importante la capacidad extractiva del sistema sobre las proteínas de peso molecular intermedio (20 – 45 kDa), permaneciendo en la fase BOTTOM sólo cantidades importantes de proteínas de peso 16 kDa compatibles con fosfolipasas y de 55 kDa compatibles con proteasas dadas las actividades enzimáticas detectadas. Mediante un simple proceso de ultrafiltración, se separó la fosfolipasa A2 con alto grado de pureza, con actividad fosfolipasa positiva y carente de actividad proteolítica, determinándose su naturaleza acídica mediante cromatografía de intercambio iónico. El reparto, empleando SBAs resultó ser una metodología apropiada para pre-purificar proteínas a partir de una mezcla compleja, como es el veneno ofídico, sin alterar su actividad biológica, Dado que se trata de una técnica, sencilla, rápida y económica, los resultados alcanzados en este trabajo abren un abanico de posibilidades para el aislamiento de otros componentes a través del ajuste de múltiples variables, como pH, temperatura, fuerza iónica, que condicionan el reparto de proteínas entre ambas fases.