Caracterización fisicoquímica de la interacción entre un fragmento de anticuerpo simple cadena (scfv) y tritón x-114.

PELLEGRINI MALPIEDI, LUCIANA; DIAZ, CÉSAR A; NERLI, BIBIANA; PESSOA JR, ADALBERTO

Rosario

Congreso; XVIII Congreso Argentino de Fisicoquímica y Química Inorgánica; 2013

Asociación Argentina de Investigación Fisicoquímica

Introducción: Desde el advenimiento de la biología molecular, existe un creciente interés en el estudio de los fragmentos de anticuerpo (scFv) para su aplicación en diferentes terapias médicas. Los scFv presentan varias ventajas respecto a los anticuerpos completos como rapidez para penetrar en los tejidos, fácil manipulación y posibilidad de ser producidas en sistemas de expresión simples como levaduras y bacterias. Objetivo: Evaluar eventuales cambios estructurales en la molécula scFv anti-LDL oxidada, resultantes de su interacción con el surfactante no iónico tritón X-114, de modo de validar la aplicabilidad del detergente en la extracción del anticuerpo con sistemas bifásicos acuosos micelares a partir de un medio de cultivo de Pichia pastoris. Resultados: La caracterización fisicoquímica del sistema anticuerpo-detergente se realizó mediante: -determinación de espectros de dicroísmo circular (DC); -análisis de espectros de emisión de fluorescencia; -estimación de la hidrofobicidad superficial relativa (S0) con la sonda fluorescente 1-anilino 8-naftalen sulfonato de magnesio y -extinción de la fluorescencia nativa con acrilamida. Adicionalmente, se evaluó el efecto del surfactante sobre la estabilidad térmica y química del anticuerpo mediante espectroscopia de fluorescencia. Los espectros de DC en el UV lejano no mostraron cambios significativos sugiriendo que la presencia de tritón X-114 (1 % P/P) no produce modificaciones en la estructura secundaria del scFv (1,6 mM). Los espectros de emisión (lexcitación 294 nm) mostraron exaltación de la señal fluorescente y corrimiento del pico emisivo hacia el azul compatible con una disminución en la polaridad del medio debida a la presencia de moléculas de tritón X-114 en el entorno de los triptófanos. En correspondencia con estos resultados se observó una marcada perturbación de los espectros de DC en el UV cercano (proximidades de 275 nm). La hidrofobicidad superficial relativa del scFv no se vio modificada por la presencia del surfactante y su valor (S0=0,020 mg/ml-1) resultó comparable con el obtenido para proteínas de carácter hidrofílico como tripsina. La extinción de la fluorescencia nativa del scFv por acrilamida ajustó a un modelo de esfera de acción cuyas constantes estáticas (V) y dinámicas (Ksv) fueron estimadas mediante la ecuación de Stern Volmer modificada. En presencia de tritón Ksv disminuyó desde 10,64 hasta 8,27 M-1sugiriendo una mayor viscosidad en el entorno de los fluoróforos mientras que la componente estática V resultó similar en ausencia y presencia de tritón (2,6 y 2,0 M-1 respectivamente), indicando que el detergente no afecta la accesibilidad del extintor a los fluoróforos. Los estudios de estabilidad mostraron que en presencia del detergente el scFv mantiene su integridad estructural frente a urea 4 M y a temperaturas de 40 °C. Conclusión: Puede concluirse que las moléculas de scFv en presencia del surfactante tritón X-114 no sufren cambios estructurales de magnitud en las condiciones de trabajo, validando la utilización de sistemas acuosos micelares formados por dicho detergente en la recuperación de scFV a partir de sus medios de expresión.