Aplicación del equilibrio de dos fases liquidas acuosas al aislamiento de fosfolipasa a2 del veneno de bothrops alternatus.

GÓMEZ, GABRIELA; NERLI, BIBIANA; ACOSTA, OFELIA; PICÓ, GUILLERMO; LEIVA, LAURA

Córdoba

Congreso; XVII Congreso Argentino de Fisicoquímica y Química Inorgánica. Asociación Argentina de Investigación Fisicoquímica; 2011

Bothrops alternatus es un ofidio muy distribuido en sudamérica, siendo responsable de la mayoría de las muertes por mordeduras de serpientes en el nordeste argentino. El aislamiento e identificación de los componentes proteicos del veneno permite la producción de sueros más específicos y por ende un mejoramiento de las terapias con anticuerpos. Los métodos convencionales para el aislamiento de toxinas ofídicas son costosos y comprenden una compleja secuencia de cromatografías. La extracción líquido-líquido con sistemas bifásicos acuosos (SBAs) constituye una metodología de creciente empleo en los últimos años en protocolos de purificación de diferentes proteínas debido a ventajas tales como su fácil escalado, bajo costo, rapidez y simplicidad. Al presente no se ha evaluado su aplicabilidad en la purificación de proteínas ofídicas. El objetivo de este trabajo fue aislar, mediante la extracción liquido-líquido empleando SBAs, una enzima con actividad fosfolipásica (fosfolipasa A2) del veneno de Bothrops alternatus. Se emplearon SBAs formados por un polímero de cadena flexible, polietilenglicol de peso molecular promedio 3300 (PEG3300) y una sal de anión liotrópico, fosfato de potasio (Pi). El SBA se preparó por gravimetría (12,3 – 13,7 - 74 % P/P de Pi, PEG3300 y agua respectivamente) obteniéndose dos fases acuosas, superior rica en polímero e inferior, enriquecida en la sal. La adición del veneno y posterior mezclado a 25ºC, permitió el reparto de sus componentes en ambas fases. El equilibrio de reparto de cada fracción proteica se evaluó midiendo las actividades proteolítica y fosfolipásica en ambas fases mediante los tests de azocaseína y hemólisis radial indirecta, respectivamente, en cada fase. La composición de los extractos se evaluó mediante electroforesis (PAGE) en condiciones desnaturalizantes. Los resultados obtenidos mostraron la capacidad del SBA de extraer en su fase inferior proteínas de peso 55 kDa compatibles con proteasas y de 14 kDa compatibles con fosfolipasas, separándolas del resto de los componentes del veneno crudo. Un paso ulterior de cromatografía de filtración molecular permitió aislar fosfolipasa A2, cuya pureza fue evidenciada por la presencia de una banda homogénea de 14 kDa en PAGE en condiciones reductoras. La enzima aislada mostró una actividad fosfolipásica directa 1,7 veces superior a la exhibida por el veneno entero; una Dosis Hemolítica Mínima (masa de enzima necesaria para producir un halo de hemólisis de 15 mm de diámetro) de 0.96 μg, 6 veces más hemolítica que el veneno entero. La Dosis Edematizante Mínima (microgramos de enzima que provocan un aumento en el peso de la pata inoculada respecto de la contralateral en un 30 %) fue de 66,7 μg, en tanto que para el veneno entero se registró un valor de 4,4 μg. La extracción líquido-líquido resultó apropiada para pre-purificar la enzima a partir de una mezcla compleja como es el veneno crudo. La combinación con una cromatografía de tamiz molecular, optimizó su aislamiento.