“Estrategias para incrementar los niveles de acumulación de transglutaminasa tisular humana (htTG) en plantas: estudio del efecto de distintas señales de direccionamiento”

MARIN VIEGAS VANESA SOLEDAD

Universidad Nacional de La Plata

Año: 2012 p. 54

La transglutaminasa tisular humana (htTG) es una proteína de interés para el diagnóstico de la enfermedad celiaca ya que es el principal antígeno reconocido por los sueros de estos pacientes. Para diagnosticar por ensayos serológicos es necesario obtener la proteína pura. Por otro lado, las plantas constituyen un sistema de expresión adecuado para la síntesis proteínas tóxicas. El objetivo de este trabajo fue expresar htTG en plantas empleando una estrategia de direccionamiento a la vía secretoria para reducir los efectos tóxicos de esta proteína.  Se diseñó también una construcción reportera para evaluar de una manera más rápida la expresión y ajustar las condiciones que permitan obtener la mayor acumulación de htTG. La construcción reportera fue una fusión de htTG a la proteína reportera mCherry y a una señal de direccionamiento vacuolar. La elección de mCherry fue porque es estable a pH ácido de la vacuola. Se hicieron agroinfiltraciones empleando distintas cantidades de Agrobacterium tumefaciens GV3101 llevando el plásmido pGWB2-Cherry-htTGvac y se evaluó la presencia del reportero por microscopia fluorescente. Los mejores niveles de expresión se obtuvieron con una DO 600  1, al quinto día postinfiltración. La presencia del supresor de silenciamiento postranscripcional P19 incremento los niveles de acumulación. Se verificó que la proteína fluorescente se acumulaba en la vacuola central de hojas por microscopia confocal. Una vez optimizadas las condiciones se estudio la síntesis de htTG dirigida a citoplasma, apoplasto, retículo endoplásmico y vacuola. El estudio de extractos de las hojas agroinfiltradas con estas construcciones por inmunoblot revelados con un anticuerpo monoclonal especifico de htTG y un anti-histidinas, mostró la presencia de htTG en retículo endoplásmico y en vacuola confirmando de esta manera que el direccionamiento a la vía secretoria permite incrementar la acumulación de esta proteína en células vegetales. La utilidad de esta proteína en el desarrollo de métodos de screening de enfermedad celiaca será evaluada en un futuro.