OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE ANTICUERPOS DE DOMINIO ÚNICO DERIVADOS DE CAMÉLIDOS (NANOANTICUERPOS O VHH) ESPECÍFICOS CONTRA LA CEPA O1 CAMPOS DEL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA PARA APLICACIÓN DIAGNÓSTICA

BOZZO JI; MATTION N; GRIPPO V

CABA

Congreso; XII Congreso Argentino de Virología; 2017

Asociación Argentina de Microbiología

La Fiebre Aftosa (FA) es una enfermedad viral del ganado de graves repercusiones económicas. Existen siete serotipos del Virus de la FA (VFA): O, A, C, SAT1, SAT2, SAT3 y Asia1; habiendo los tres primeros circulado en Argentina. El desarrollo de métodos diagnósticos innovadores que respondan a las necesidades de control de la FA es de gran interés debido a la elevada variabilidad que presenta el virus, la facilidad de contagio y la susceptibilidad de especies de interés económico. A su vez, los anticuerpos (Acs) de dominio único derivados de camélidos (Nanoanticuerpos o VHH) representan una herramienta novedosa con características únicas en comparación con los Acs convencionales. Se caracterizan por su alta especificidad, estabilidad, afinidad por el blanco y reducido tamaño. Esto último permite fijar mayor densidad de Acs incrementando notablemente la sensibilidad diagnóstica. Por esta razón, el presente trabajo tuvo como objetivo obtener, expresar y caracterizar preliminarmente VHH específicos contra la cepa O1/Campos (O1C) del VFA para su posterior aplicación en la innovación diagnóstica.Para lograr tal objetivo, dos llamas (Lama glama) fueron inmunizadas con la cepa O1C y se construyeron dos bibliotecas de Nanoanticuerpos en el vector fagémido pHEN4 a partir de la sangre total periférica de estas llamas. Partiendo de estas bibliotecas inmunes, se seleccionaron fagos que expresaron en su superficie VHH específicos contra la cepa O1C por la metodología de Phage Display. Se observó que 137 de 182 clones seleccionados reconocieron específicamente tal cepa en ELISA. De estos clones, se eligieron 17 que presentaron muy alta reactividad en ELISA y no presentaron reactividad cruzada con otros serotipos del VFA (A24/Cruzeiro, A/Arg/2001 y C3/Indaial). Seguidamente, se estudió la diversidad de estos clones por digestión enzimática con la enzima de restricción HinfI y se evidenció que 12 de los 17 clones presentaron perfiles de digestión diferentes. En una primera etapa, 6 de estos clones diferentes fueron sub-clonados en el vector de expresión pHEN6. Su diversidad y clonado en fase fue corroborado por posterior secuenciación. Luego, estos Nanoanticuerpos se expresaron en forma soluble a gran escala en la cepa WK6 de E. coli y se observó una única banda del tamaño esperado (15Kda) correspondiente VHH en ensayos de Western blot. La reactividad de estos Acs solubles se caracterizó preliminarmente por ELISA y Western blot contra los distintos serotipos del VFA.En conclusión, se obtuvieron al menos 12 Nanoanticuerpos diferentes y específicos contra la cepa O1C. De estos 12 VHH, 6 fueron sub-clonados y expresados en forma soluble en bacteria. Estos Nanoanticuerpos se caracterizaron preliminarmente en ensayos de ELISA y Western blot contra VFA. Estos anticuerpos representan una herramienta para la innovación de métodos diagnósticos actuales y la tipificación del serotipo O1C del VFA.