OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS DE DOMINIO ÚNICO DERIVADOS DE CAMÉLIDOS (NANOANTICUERPOS O VHH) QUE RECONOCEN ESPECÍFICAMENTE LAS PARTÍCULAS 146S DE LA CEPA O1/CAMPOS DEL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA.

BOZZO JI; MARCHESE F; GONZALEZ M; SEKI C; PERIOLO O; MATTION N; GRIPPO V

VALLE HERMOSO, CORDOBA

Congreso; XXXVIII Reunión Científica Anual SAV; 2018

SAV-AAM

Argentina posee el estatus de libre de Fiebre Aftosa (FA) otorgado por la OIE con zonas diferenciadas por la aplicación o no de la vacuna (zonas libres con vacunación y libres sin vacunación). En cuanto a la calidad de la vacuna, el componente inmunogénico principal es la partícula viral intacta (146S), la cual puede disociarse en productos de degradación específicos (12S) reduciendo la potencia de la vacuna. El contenido de 146S se mide por la integración del pico viral purificado en gradiente de sacarosa midiendo su absorbancia a 260 nm. Este método es sensible pero es laborioso y requiere de equipamiento costoso. En el laboratorio, se han desarrollado numerosos anticuerpos (Acs) monoclonales convencionales contra las cepas sudamericanas del virus de FA (VFA) pero ninguno ha reconocido exclusivamente 146S para su aplicación en el desarrollo de un método más simple y adecuado en el control de la producción de la vacuna. A su vez, los Acs de dominio único derivados de camélidos (NanoAcs o VHH) presentan características únicas comparados con los Acs convencionales, en particular reconocen epitopes inaccesibles para estos últimos. Por esta razón, el objetivo de este trabajo fue obtener VHH capaces de reconocer específicamente las partículas 146S de la cepa O1/Campos del VFA. Para lograr tal objetivo, se construyeron bibliotecas inmunes de VHH y seleccionaron NanoAcs específicos contra esta cepa por Phage display. Los 13 VHH más reactivos fueron expresados en bacteria detectándose una única banda del PM esperado (15kDa) por Western Blot. Para evaluar la reactividad de los VHH contra las distintas partículas, se purificaron las 146S y, a partir de éstas se generaron las 12S por tratamiento térmico. El proceso total de degradación a 12S se verificó por sedimentación en gradiente de sacarosa y ELISA. Se determinó que 3 de los 13 VHH expresados (periplasma) presentaron una alta reactividad contra 146S y baja reactividad contra 12S en ELISA. Posteriormente, se purificaron por IMAC tanto VHH que reconocieron preferencialmente 146S como NanoAcs que reconocieron ambas partículas (controles). La reactividad de los VHH purificados se probó contra ambas partículas en ELISA. Finalmente, se separaron por gradiente de sacarosa partículas 146S purificadas y 12S generadas por tratamiento térmico. La reactividad de los VHH contra todas las diferentes fracciones del gradiente se evaluó por ELISA, corroborando fehacientemente que los VHH reconocieron específicamente las partículas 146S y no así las 12S.En conclusión, se obtuvieron VHH capaces de reconocer específicamente las partículas 146S y con baja reactividad contra las partículas 12S generada por tratamiento térmico. Estos Acs son de gran interés para desarrollar un ELISA que permita cuantificar la proporción de partículas intactas (146S) en los distintos pasos de producción de la vacuna. Esto representaría una metodología más rápida y sencilla que la utilizada actualmente en el control de calidad de la vacuna.n