PRODUCCIÓN DE FRAGMENTO DE CADENA SENCILLA DIRIGIDOS CONTRA EL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA

MAURO GONZALEZ; DENISE NÚÑEZ; MICAELA ZIRALDO; ALEJANDRA D'ANTUONO

Ciudad de Buenos Aires

Jornada; IX JORNADAS DE JÓVENES INVESTIGADORES; 2020

Faculta de Ciencias Veterinarias de la UBA

Los fragmentos derivados de anticuerpos recombinantes (rAb), y particularmente losfragmentos variables de cadena sencilla (single-chain variable fragment - scFv), han surgidorecientemente como una alternativa al empleo de anticuerpos monoclonales (mAbs) para eldiagnóstico médico y aplicaciones terapéuticas. Los scFv contienen el sitio completo deunión al antígeno, que incluye los dominios variables de la cadena pesada (VH) y liviana(VL) de un Ab, fusionados en fase por un polipéptido flexible [por ejemplo (GGGGS)x3].Este tipo de rAb es el más frecuentemente utilizado, dado que es posible generar scFVespecíficos y con elevada afinidad contra cualquier molécula blanco mediante variossistemas de expresión. El objetivo de este trabajo fue generar scFv a partir de hibridomassecretores de mAb dirigidos específicamente contra el Virus de la Fiebre Aftosa serotipoA24. Para ello, inicialmente se aisló el RNA total a partir del cultivo de los hibridomas 1E12y 4A2, disponibles en el CEVAN, que reconocen la proteína capsidal VP1 del VFA. Pormedio de una reacción de RT-PCR, utilizando oligonucleótidos degenerados, se amplificaronlas porciones VH y VL que codifican para las inmunoglubulinas murinas de cada hibridoma.Una vez definidas las secuencias VH y VL, se diseñaron 4 oligonucleótidos específicos parala construcción del scFv mediante la técnica de PCR de fusión, que permite el empalme defragmentos de ADN en un polinucleótido de mayor tamaño. El amplicón obtenido (800pb)fue clonado en el vector pHEN6 entre los sitios NcoI/BstEII. Este vector incorpora el péptidoseñal pelB, que la direcciona al espacio periplásmico de las células, en el extremo amino dela proteína de interés, y una etiqueta constituida por 6 residuos de histidina, en su extremoC-terminal. En conclusión, se lograron amplificar las regiones VH y VL de lasinmunoglobulinas secretadas por los hibridomas 4A2 y 1E12. Se generaron los fragme ntosscFv4A2 y scFv1E12, donde se fusionaron en fase los dominios variables H y L de cadahibridoma por medio de un linker. Las moléculas de ADN recombinante se clonaron en unvector de expresión procariota.