ESTRATEGIAS DE OPTIMIZACIÓN DE VECTORES ADENOVIRALES RECOMBINANTES PARA MEDIAR LA GENERACIÓN DE PARTÍCULAS SIMILARES AL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA

MICAELA ZIRALDO; MAURO GONZALEZ; DENISE NÚÑEZ; ALEJANDRA D'ANTUONO

Ciudad De Buenos Aires

Jornada; IX JORNADAS DE JÓVENES INVESTIGADORES; 2019

Faculta de Ciencias Veterinarias de la UBA

Considerada por la Organización Mundial de Sanidad Animal como la principal enfermedadanimal de declaración obligatoria, la fiebre aftosa (FA) es una enfermedad que afecta a unaamplia variedad de animales biungulados, cuyo agente etiológico es el virus de la fiebreaftosa (VFA). Dados los recientes brotes en países libres de FA, causantes de cuantiosaspérdidas económicas, existe un continuo interés en desarrollar vacunas que no estén basadasen el cultivo de VFA infectivo. En ese sentido las partículas tipo virus (PTV), desprovistasdel genoma viral, se presentan como inmunógenos atractivos ya que conservarían todo elrepertorio de epitopes conformacionales del virus salvaje. Nuestro laboratorio desarrolló unvector derivado de Adenovirus (Ad) que porta un cassette que expresa la poliproteína P12A-3C, que incluye las proteínas que conforman la cápside del VFA cepa O1 Campos más laproteasa viral 3C (AdOP). El análisis de las subunidades generadas reveló que las proteínasvirales estructurales se asocian formando un complejo macromolecular con velocidad desedimentación intermedia entre las subunidades 75S (PTV) y 12S (capsómeros) del VFA.Así el objetivo de este trabajo fue generar un nuevo Ad que favorezca el ensamblado de PTVdel VFA. Para conseguirlo, se introdujeron mutaciones puntuales en la secuencia que codificala proteína capsidal VP2, que estabilizarían la interfaz entre los protómeros que conformanla cápside viral, y mutaciones en la secuencia de la proteasa viral 3C, que disminuirían suactividad proteolítica, favoreciendo la sobrevivencia de las células huéspedes. De esta formase generaron el genoma pAdOP[VP2S93F/Y98F] que porta la mutación doble S93F/Y98F en VP2y los genomas pAdOP[3CC142S] y pAdOP[3CG38S/F48S] que portan las mutaciones C142S yG38S/F48S, respectivamente, en 3C. Por medio de experimentos de Western blot de lisadosde células transfectadas, se verificó que los nuevos vectores dirigen la expresión y el correctoprocesamiento de las proteínas estructurales VP1 y VP3. A continuación, se rescataronexitosamente cada uno de los Ad y se evaluó su capacidad de dirigir el ensamblado en PTVde las proteínas heterólogas del VFA. Para ello, se procesaron por centrifugación engradientes de sacarosa extractos citoplasmáticos de células infectadas con cada uno de losAd y se analizaron las fracciones por ELISA. Estos experimentos permitieron identificar enlos tres lisados un componente mayoritario con una velocidad de sedimentación intermediaentre las subunidades 75S y 12S del VFA, pero lo más relevante fue que en el caso deAdOP[VP2S93F/Y98F] se observó un componente adicional con una velocidad de sedimentac iónsimilar al de las cápsides vacías. En conclusión, los resultados muestran el vectorAdOP[VP2S93F/Y98F] dirige la expresión de elevados niveles de proteínas capsidales del VFA,sugiriendo además que la presencia de la doble mutación en VP2 favorecería el ensambladode PTV por un fenómeno de estabilización de las mismas. En cambio no se encontróevidencia que las mutaciones en 3C favorezcan la formación de PTV