Efecto citotóxico de extractos de Baccharis incarum sobre células tumorales humanas”

ZAMPINI I.C.,; ISLA M. I.

Tucumán

Jornada; 1º Jornadas de Jóvenes Investigadores; 2007

AUGM-UNT

Baccharis incarum es una especie perteneciente a la familia Asteraceae, ampliamente distribuida en zonas áridas de Argentina. Es un arbusto ramoso, altamente resinoso, de hasta 50 cm de altura, posee floración muy abundante entre fines de verano y principio de otoño. Crece a más de 3800 metros sobre el nivel del mar (Cabrera Ref.1,2,3), soportando condiciones extremas de temperatura, aridez, baja presión atmosférica y elevada intensidad de radiación solar. Baccharis incarum es conocida en la región de la Puna con los nombres comunes de “lejía”, “tola o t’ula” (Aymara y Quechua). Las hojas tostadas y hervidas sirven como bebida para combatir la tos, bronquitis, resfríos y neumonía, para la fiebre, hígado o dolor de estómago. El alcohol en que se han macerado las hojas durante varios días, se usa en fricciones contra los dolores reumáticos (Castro Ref.4, Lucca y Zalles Ref.5, Wickens Ref.6). La resina de esta planta se consume como dulce en el invierno (Aldunate Ref.7). Las flores son apreciadas por la resina que contienen en casos de contusiones, heridas, como también para consolidar las luxaciones y quebraduras (Araya-Presa Ref.8). En trabajos previos demostramos que extractos de esta planta presentan capacidad depuradora de especies de oxígeno reactivo (EOR) por lo que pueden ser considerados como candidatos para la prevención de enfermedades degenerativas asociadas al estrés oxidativo tales como arteriosclerosis y cáncer (Zampini et al, Ref. 9,10). Las estrategias de los tratamientos contra diferentes tipos de tumores están enfocadas directamente a inhibir la proliferación de células tumorales o remover selectivamente células transformadas induciendo su apoptosis o eliminando la causa del desarrollo celular ilimitado (Balasubashini Ref.11). Desde hace tiempo las plantas son evaluadas en búsqueda de agentes antitumorales y muchos compuestos anticáncer fueron aislados de ellas, tales como los taxoles, vincristina o vinblastina. En general, las sustancias de origen vegetal son sometidas a pruebas de actividad biológica para monitorear la presencia de compuestos tóxicos y antitumorales de utilidad potencial. El bioensayo de Artemia salina, que se caracteriza por su rapidez, confiabilidad y bajo presupuesto de ejecución, es utilizado como vía inicial de tamizaje citotóxico de extractos vegetales y presenta buena correlación con la toxicidad in vitro sobre células tumorales (Meyer Ref.12). El ensayo del MTT (bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazolium), es ampliamente utilizado para determinar citotoxicidad sobre líneas celulares, se trata de un ensayo colorimétrico basado en la reducción de la sal de tatrazolium (MTT) a cristales de azul de formazán, por acción de las oxidorreductasas celulares y la cantidad de formazán producido es proporcional al número de células viables. El objetivo de este trabajo fue evaluar el potencial citotóxico de extractos de Baccharis incarum sobre líneas celulares tumorales. Materiales y Métodos: Partes aéreas de Baccharis incarum fueron recolectadas en febrero de 2005 en Antofagasta de la Sierra, Catamarca, Argentina (Fig 1). Una vez desecado el material fue triturado y extraído por maceración con etanol 80º. El contenido de compuestos fenólicos totales de las tinturas fue determinado por el método espectrofotométrico descripto por Singleton et al 1999 (Ref.13) y fue expresado en equivalentes de ácido gálico, La actividad citotóxica de los extractos fue evaluada utilizando el micro-ensayo de letalidad de Artemia salina (Solis Ref.14), existen evidencias a cerca de la correlación positiva entre éste y ensayos in vitro sobre células de carcinoma humano nasofaríngeo (9KB). Los huevos de A. salina, disponibles comercialmente, fueron colocados para su eclosión, en una cámara de dos compartimentos (uno oscuro y el otro iluminado por una lámpara colocada a una distancia aproximada de 30 cm) conteniendo agua de mar artificial. (Fig.2). Después de 24 hs de incubación, a una temperatura aproximada de 30°C, las larvas de A salina desarrolladas a partir de los huevos, fueron colectados con pipeta del extremo iluminado de la cámara, ya que éstos organismos presentan un gran fototropismo. Diluciones seriadas del extracto de B. incarum disuelto en dimetilsulfóxido (DMSO) fueron depositadas en policubetas de 96 pocillos y 100 µL de agua de mar, conteniendo 10 individuos de A. salina, fueron agregados a cada pocillo. Pocillos conteniendo DMSO fueron incluidos en el ensayo (control negativo) como así también controles positivos de dicromato de potasio. Las pruebas fueron realizadas por triplicado. Las placas cubiertas fueron incubadas por 24 hs a 30°C, luego examinadas bajo lupa y el número de camarones muertos (sin movilidad) en cada pocillo fueron contados. Luego fueron adicionados 100 µL de metanol a todos los pocillos y después de 15 minutos el número total de camarones en cada pocillo fue contado. Los datos fueron analizados con el programa Finney para análisis estadístico y los valores de CL50 (concentración letal 50) fueron calculados (Finney Ref.15). Por otro lado, se determinó la citotoxicidad de las muestras sobre células humanas de carcinoma epidermoide de laringe, Hep-2, mediante un ensayo colorimétrico utilizando bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazolium (MTT), basado en la reducción de la sal de tetrazolium (MTT) a cristales de azul de formazán por acción de las oxidoreductasas celulares (Lee Ref.16) y la cantidad de formazán producido es proporcional al número de células viables. Las células HEp-2 fueron colocadas en placas de 12 pocillos e incubadas durante 24 hs a 37°C y atmósfera de CO2, luego el medio de cultivo fue reemplazado por medio fresco y fueron expuestas a diluciones seriadas de extractos de Baccharis incarum disuelto en DMSO, durante 24 hs. Pasado el tiempo de tratamiento, las células fueron lavadas con buffer fosfato salino (PBS) y luego a cada pocillo fueron adicionados medio fresco libre de suero y una solución de MTT (0,5mg de MTT/ml PBS). Después de 4 hs de incubación a 37°C la solución de MTT fue removida y los cristales de azul de formazán formados en cada pocillo fueron disueltos en isopropanol acidificado (isopropanol con HCl 0,04N). La densidad óptica de formazán fue medida espectrofotométricamente a 570 nm. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado. El rango de concentración de compuestos fenólicos utilizados en ambos ensayos fue de 0,025 a 20 µg/mL.