Desarrollo de un bioreactor con tripsina unida covalentemente a esferas de quitosano para la hidrólisis controlada de proteínas del suero de leche

BALLERINI, G. A.; BÁEZ, G. D.; BUSTI, P. A.; DELORENZI, N. J.

Rosario

Congreso; X. Congreso, XXVIII Reunión anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2008

Sociedad de Biología de Rosario

Productos derivados del lactosuero son usados en la industria alimenticia como aditivos, debido al aporte variado de propiedades funcionales (estabilidad térmica, gelificación, formación de espumas y emulsiones). Estas propiedades funcionales de los productos del lactosuero pueden mejorarse por hidrólisis enzimática con proteasa específicas. En este trabajo se optimizó el pegado covalente de tripsina a esferas de quitosano para su aplicación en biorreactores (escala de laboratorio) para la hidrólisis controlada de la beta-lactoglobulina (B-LG), proteína mayoritaria que digita el comportamiento de los productos derivados del lactosuero. Para la preparación de los geles de quitosano, se usó la técnica de Manrich, modificada por nuestro grupo de trabajo. Se disolvió quitosano al 2,5% (p/p) en ácido acético 5% (p/p) durante 24 horas a temperatura ambiente. La solución resultante se colocó en un dispositivo de diseño y construcción propias, para ser vertida sobre la solución de coagulación, agitando hasta gelificación completa de las partículas. Las esferas de diámetro promedio igual a 2,5 mm fueron lavadas con agua y conservadas en pH alcalino. El soporte se activó con glutaraldehido al 5% (p/p) en buffer bicarbonato de sodio 100 mM, pH 10,0, manteniéndose en contacto durante 1 h a baja temperatura para disminuir el grado de polimerización. La activación del soporte implica la aparición de grupos carbonilos muy reactivos en la superficie para la formación de bases de Shiff con la enzima. Para el pegado covalente de enzima a las esferas de quitosano se puso en contacto la enzima con el soporte activado en una relación Vgel/Vtotal = 1/10 (solución de tripsina en bicarbonato de sodio 100 mM, pH 10,0), a 25 ºC, y con agitación magnética durante 24 h. Para comprobar la fijación de la enzima al soporte se enfrentaron, alícuotas del sobrenadante recolectadas a dstintos tiempos, con solución de BAPNA (sustrato específico de la tripsina). Se determinó la actividad enzimática en el líquido remanente a partir de una curva estándar Abs430 vs mmoles p-nitro anilina obtenida por reacción equimolar BAPNA-Tripsina. Esta curva y cada una de las obtenidas para cada alícuota permitió obtener la actividad de la tripsina expresada como mg BAPNA por mg de tripsina y por minuto, por diferencia. Las esferas se lavaron y se conservaron a 4ºC. Se optimizó la masa de soporte con tripsina inmovilizada para un volumen dado de biorreactor que se usó en la hidrólisis controlada de la B-LG, incubando a 37 ºC durante lapsos de tiempo comprendidos entre 1 y 5 h, luego de lo cual se detuvo la reacción por calentamiento a 80ºC durante 5 min. El grado de hidrólisis se determinó por el método del TNBS. La composición en péptidos, por electroforesis SDS-PAGE en medio desnaturalizante no disociante para pesos moleculares entre 14.000 y 66.000 y aplicando el método modificado de Swank-Munkres para pesos moleculares entre 3.500 y 17.000.