PERSONAL DE APOYO
REINER gabriela De Las Nieves
congresos y reuniones científicas
Título:
EVALUACION DE LA CITOTOXICIDAD DE COMPUESTOS FENÓLICOS CON ACTIVIDAD GABAÉRGICA.
Autor/es:
LETICIA E. DELGADO-MARÍN; GABRIELA N. REINER; ENEIDA DE PAULA; DANIEL A. GARCÍA
Lugar:
Mar del Plata
Reunión:
Congreso; XXIX Congreso Argentino de Química; 2012
Institución organizadora:
Asociación Química Argentina
Resumen:
Introducción El receptor GABAA es el principal receptor inhibitorio del sistema nervioso central. Posee diferentes lugares de reconocimiento para la unión de ligandos específicos y moduladores. Estos compuestos son potencialmente útiles en medicina humana como agentes analgésicos, anestésicos, ansiolíticos y anticonvulsivantes. Los moduladores más conocidos son benzodiazepinas, barbitúricos y neuroesteroides entre otros. Cada uno de estos compuestos se comporta como modulador alostérico de los demás potenciando, en general, su unión al receptor [1]. Recientemente, nuestro grupo de trabajo ha descripto a diferentes compuestos fenólicos derivados del propofol, un reconocido agente gabaérgico, como modulares positivos de dicho receptor [2,3,4,5]. En el presente trabajo, se evalúa la citotoxicidad de estos compuestos, incluyendo a propofol como referencia, a concentraciones similares a las que demostraron efectos farmacológicos. Metodología Se incluyeron en el presente trabajo cinco compuestos fenólicos: eugenol, timol, propofol y carvacrol y clorotimol. Propofol es un compuesto de síntesis, clorotimol es un monoterpenoide derivado de timol y los demás son componentes importantes de numerosos aceites esenciales. Timol y carvacrol son extraídos de aceites esenciales de numerosas especies de tomillo (género Thymus) y de orégano (gen. Origanum) respectivamente, mientras eugenol se encuentra en numerosas especies como la albahaca y el clavo de olor (gen. Ocimum y Syzygium) [6,7]. Se realizaron cultivos primarios de neuronas corticales de embriones de rata (16-18 días de gestación) y se determinaron sus efectos sobre la viabilidad celular a través de la evaluación de la integridad mitocondrial de la célula (reducción de MTT) y de la integridad de la membrana celular (liberación de Lactato Deshidrogenasa –LDH). Los cultivos y ambas técnicas nombradas se realizaron según lo indicado en García et al., (2006) [3]. Brevemente, se disecan las cortezas cerebrales de embriones de ratas de 16-18 días de gestación y tras la digestión con tripsina, se centrifuga y aspira el sobrenadante para luego proceder a la digestión mecánica. Las células obtenidas se resuspenden en medio de cultivo apropiado. Los ensayos se realizan entre los 6-7 días in vitro, cuando estas células expresan el receptor GABAA funcional. Para valorar la toxicidad de los compuestos se analizó paralelamente su capacidad de inducir hemólisis en condiciones isotónicas, siguiendo la técnica descripta por Malheiros et al. [8]. La sangre fue suministrada por el banco de sangre del Hemocentro de Campinas. Los eritrocitos fueron obtenidos y diluidos en PBS, pH 7.4, hasta una absorbancia aproximada de 0,9 a 412 nm (hematocrito del 0,15%). Luego, se prepararon las muestras con los correspondientes compuestos fenólicos y se dejó incubar durante 15 minutos a 37°C. Finalmente, después de una centrifugación a 1500 g por 10 min, se midió la concentración de hemoglobina liberada al sobrenadante para calcular el porcentaje de hemólisis (% H) como se describe a continuación: % H = [(AS - APBS) / (AH2O - APBS)] * 100 donde AS , APBS y AH2O corresponden a las absorbancias a 412 nm de la solución de eritrocitos en presencia del compuesto (muestra), resuspendidos en buffer (control) o resuspendidos en agua (100% hemólisis), respectivamente. Resultados El análisis de los resultados de los ensayos de citotoxicidad, realizados en neuronas corticales, mostró que ninguno de los compuestos ensayados disminuyó significativamente la viabilidad celular a concentraciones donde los mismos demostraron tener actividad sobre el receptor GABAA. Esto implica que la presencia de los compuestos fenólicos ensayados, al menos hasta 24 hs posteriores a su incorporación al medio de cultivo, no alterarían la integridad mitocondrial y de la membrana plasmática de las neuronas a concentraciones farmacológicamente activas. Sin embargo, en caso del clorotimol, si bien no demostró un claro efecto sobre la viabilidad neuronal según los ensayos realizados, las células mostraron signos morfológicos de daño a concentraciones mayores a 100 μM. Los resultados de hemólisis mostraron que ninguno de los productos ensayados indujo la rotura de los eritrocitos como consecuencia de su actividad sobre la membrana de los mismos ya que los porcentajes de hemólisis no fueron significativamente diferentes a la muestra control (eritrocitos en ausencia de los compuestos). Conclusiones Los datos obtenidos de los ensayos realizados sugieren la ausencia de citotoxicidad de los compuestos fenólicos estudiados al menos hasta 24 hs de exposición a los mismos y a concentraciones similares a las farmacológicamente activas sobre el receptor GABAA. A pesar de su alta lipofilicidad y tendencia a particionarse en fases membranosas [9] ningún compuesto mostró capacidad hemolítica.