INVESTIGADORES
ETCHEVERRIA Analia Ines
congresos y reuniones científicas
Título:
Condiciones sobre la aplicación de PCR en el Laboratorio de Leptospirosis
Autor/es:
LUCCHESI, PAULA M.A.; ARROYO, GUILLERMO H.; ETCHEVERRÍA, ANALÍA I.; PARMA, ALBERTO E.; SEIJO, ALFREDO C.
Lugar:
Buenos Aires-Argentina
Reunión:
Congreso; 2do. Congreso Argentino de Zoonosis, 1er. Congreso Argentino y 1er. Congreso Latinoamericano de Enfermedades Emergentes. Buenos Aires 14 al 17 de abril de 1998; 1998
Institución organizadora:
Asociación Argentina de Zoonosis
Resumen:
Resumen: Introducción. La lesptospirosis es una enfermedad zoonótica de amplia difusión. Algunos animales infectados desarrollan una persistente infección renal con diseminación de leptospiras al medio a través de la orin. Taxonomicamnete, las leptospiras son distribuidas en dos especies: Leptospira interrogans (patógena) y L. biflexa (saprófita), comprendiendo más de 200 serovariedades, clasificadas sobre la base de aglutininas de superficie. La presencia de la bacteria puede ser investigada mediante cultivo, aunque el procedimiento puede requerir  hasta más de dos meses. La detección de anticuerpos específicos en el suero de los pacientes mediante microaglutinación está ampliamente difundida y constituye el método de referencia. Como se requiere una prueba precoz de detección, se han desarrollado también ensayos inmunoenzimáticos, de inmunofluorescencia e hibridación con sondas oligonucleotídicas. La técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) significa una ventaja por su rapidez, sensibilidad y especificidad. Existen “primers” que permiten diferenciar leptospiras patógenas de saprófitas por medio de PCR. Previamente se estudió su especificidad y sensibilidad (10 leptospiras/tubo de reacción) con cepas aisladas en Argentina.Objetivos: Estudiar las condiciones de aplicabilidad de PCR a la detección de leptospiras en muestras clínicas.Metodología. La amplificación del AD genómico de leptospira se eefctuó mediante el uso de los primers G1/G2 y B64-I/B64-II en las condiciones descriptas en trabajos previos. La detección de los amplímeros se efectuó en un gel de azarosa al 1,5%. Leptospira interrogans serovariedad pomona fue crecida en medio EMJH durante 10-15 días a 27 ºC. Las bacterias fueron centrifugadas en microcentrífuga 20 min a 12000 rpm y lavadas dos veces con agua destilada. Luego de estandarizar la suspensión por nefelometría se adicionaron distintas alícuotas a una orina humana normal de manera de obtener una densidad de 1000, 10000, 100000 y un millón de bacterias por ml. Las variantes aplicadas al método fueron as siguientes: i) el sedimento de centrifugar 1 ml de orina a 12000 rpm fue resuspendido en 100 ml de agua destilada estéril y hervido durante 10 min.; ii) ídem pero lavando el sedimento con agua destilada; iii) alcalinización de la orina hasta pH 7.8 con Tris 1M, PBS ó HONa 0.2 M; iv) mantener la orina en su pH original (ácido); v) congelar a -20 ºC y descongelar la orina con leptospiras  antes de su procesamiento por PCR ; iv) empleo de albúmina bovina (0.013 a 0.1%) en el cocktail de PCR como captador de algunos inhibidores de la reacción. En todos los casos el ADN de leptospiras fue liberado mediante ebullición de las suspensiones en agua destilada  y entre 10 y 35 ml de la solución fue empleada en un volumen final de reacción de 50 ml. Como control de la reacción se emplearon leptospiras en ausencia de orina.Resultados y Discusión. Los controles de leptospiras sin orina siempre dieron resultados positivos. En cuanto a las distintas formas de procesar las muestras con orina, se lograron los siguientes resultados. Se observó qu eluego de 90 min de contacto de las leptospiras con orina ácida no era posible su detección por PCR. La alcalinización inmediata con PBS dio mejores resultados en la amplificación que alcalinizando con Tris o OHNa. El congelamiento y descongelamiento de la muestra, previo a su procesamiento, diminuyó notablemente las posibilidades de detección. La adición de albúmina bovina al 0.1% permitió lograr la mejor amplificación. El resultado de agregar 35 ml de muestra al tubo de reacción mejoró con respecto al uso de 10 ml. En conclusión, para esta técnica es indispensable que tanto la alcalinización como la preparación de la muestra de orina se realicen inmediatamente luego del muestreo. Sin embargo, no se pudo llegar al mayor nivel de sensibilidad que tenía la reacción sobre muestras sin orina.