IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS AISLADAS DE QUESOS ARTESANALES CON POTENCIAL PROBIÓTICO

RUIZ, MARÍA JULIA; GARCÍA, MAURO; PADOLA, NORA LÍA; MEDINA, LUIS; ETCHEVERRÍA, ANALÍA INÉS

Casilda

Jornada; XXI Jornadas de Divulgación Técnico-Científicas Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de Rosario; 2021

FCV-UNR

IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS ÁCIDO LÁCTICAS AISLADAS DE QUESOS ARTESANALES CON POTENCIAL PROBIÓTICO Ruiz MJ1, García MD1, Padola NL1, Medina Canalejo LM2, Etcheverría AI11Laboratorio de Inmunoquímica y Biotecnología, CIVETAN, CONICET, CICPBA, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNCPBA, Tandil, Argentina.2Departamento de Bromatología y Tecnología de los Alimentos, Universidad de Córdoba, España.jruiz@vet.unicen.edu.arLa producción de quesos de leche cruda se practica desde hace mucho tiempo en Europa. La fermentación espontánea de la leche no tratada aporta valiosas características sensoriales a los quesos artesanales, recibiendo un gran interés por los consumidores de todo el mundo. Los quesos de leche cruda se caracterizan por un flavour de mayor intensidad que los quesos elaborados con leche pasteurizada y se consideran productos naturales contribuyendo a una diversidad gastronómica más amplia1. Andalucía presenta una gran variedad de quesos tradicionales o artesanales caracterizados por algunos atributos como la agricultura autóctona de una determinada raza, la alimentación basada en el pastoreo, así como el conocimiento del maestro quesero transmitido de generación en generación2. El peligro asociado a la leche cruda lleva a la exigencia de una maduración mínima de 60 días y la microbiota en la leche cruda y por tanto en el queso elaborado con ella, deben tener funciones de protección frente a bacterias patógenas y presentar ventajas tecnológicas3. Una herramienta que permitiría lograr alimentos seguros es el uso de cultivos de bacterias ácido lácticas con potencial actividad antimicrobiana. Por esta razón, el aislamiento y la caracterización de cepas de BAL a partir de productos artesanales es de gran importancia ya que permite incrementar el conocimiento sobre el potencial y la aplicación de cepas autóctonas para ser utilizadas como cultivos BAL4. El objetivo principal de este trabajo fue aislar, identificar y seleccionar especies de BAL nativas de quesos con potencial antimicrobiano frente a patógenos que pudieran ser candidatos para la producción de quesos artesanales seguros.Fueron tomadas muestras de cuatro quesos artesanales semiduros comerciales de leche de oveja cruda de la región de Andalucía, España. Cada muestra de 10 g fue homogeneizada en 90 ml de solución acuosa de peptona estéril y sembradas diferentes diluciones seriadas en placas de agar MRS (Oxoid, Reino Unido) y M17 (Oxoid, Reino Unido). Las placas se incubaron a 37°C por 72 h en jarras de anaerobiosis (Anaerogen™, Thermo Scientific, EE. UU.) y a 30°C por 72 h en condiciones aeróbicas, respectivamente. Se seleccionaron aleatoriamente cien colonias (50 de agar MRS y 50 de agar M17) y se cultivaron, en las mismas condiciones, para obtener cultivos puros. Se determinó la actividad de catalasa, tinción de Gram y morfología celular y luego se realizó un screening de la actividad antimicrobiana frente a cuatro cepas de Salmonella Typhimurium mediante el método de inhibición por difusión en agar. Cada cepa se inoculó con un ansa en aguja, las placas se sometieron a vapores de cloroformo para eliminar las células y se airearon en una cabina de flujo laminar. A continuación, se añadió medio de agar XLD (Oxoid, Reino Unido) blando (0,7% p/v) con la cepa indicadora de S. Typhimurium (108 UFC/ml) cultivada previamente durante 24 h en aerobiosis a 37°C a las placas de MRS y M17. Todas las placas se incubaron durante 24 h a 37°C en condiciones aeróbicas. Aquéllas que mostraban un halo traslúcido alrededor de la colonia se consideraron positivas como productoras de compuestos antimicrobianos. Las BAL con mejor potencial inhibitorio (halos superiores a 10 mm) fueron seleccionadas para ser identificadas mediante secuenciación del ADN ribosómico 16S. La extracción de ADN se llevó a cabo a partir de cultivos de 24 h en caldos MRS y M17 de acuerdo con cada cepa seleccionada. El ADN se obtuvo con un kit de aislamiento de ADN genómico bacteriano (AN0067, Canvax Biotech S.L., España). El proceso de extracción utiliza columnas CleanEasy™ MiniSpin e incluye un paso inicial de lisis de la pared celular con la enzima adecuada para asegurar una lisis celular eficiente y la liberación de ADN de la célula. La medición de la concentración de ADN se realizó con un NanoDrop Lite (Thermo Scientific, EE. UU.). La amplificación por PCR del ADN ribosómico 16S se realizó usando un par universal de cebadores: 16SFw: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 'y 16SRv: 5'-GAAAGGAGGTGATCCAGCCG-3'. La reacción se llevó a cabo en un total de 20 μl con tampón de reacción 1x, MgCl2 2.5 mM, 100 μM de cada dNTP, 0.25 μM de cada cebador, DMSO al 1% y 1 U de Taq polymerase (BIOTOOLS B&M Labs, S.A., España). Se siguió el siguiente programa de amplificación: un primer paso de desnaturalización a 95°C durante 5 min seguido de 30 ciclos de 1 min a 95°C, 1 min a 55°C y 1 min a 72°C seguido de un paso de extensión final de 7 min a 72°C. Los productos de las reacciones de PCR se purificaron mediante precipitación con AcNa/EtOH y se resuspendieron en 15 µl de H2O mQ estéril. Se tomaron 6 µl del ADN purificado para cada reacción de secuenciación, uno para cada cebador (16SFw y 16SRv). Las secuencias obtenidas de cada aislamiento se alinearon para lograr la secuencia ribosómica 16S completa utilizando el software DNAstar MegAlign (DNASTAR Inc., EE. UU.). Finalmente, las secuencias se analizaron mediante BLAST en la base de datos GeneBank (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov).Cien colonias presuntivas de BAL fueron recolectadas de los dos medios de cultivo (agar MRS y agar M17). Todos los aislamientos fueron Gram positivos (+) y catalasa negativos (-), 37 presentaron morfología bacilar, 52 morfología esférica y 11 morfología cocobacilar. En el ensayo de difusión en agar, el 63,25% de los aislamientos mostró halo traslúcido alrededor de la punción (actividad antibacteriana positiva de BAL frente a S. Tiphymurium), el 13,25% no mostró halo traslúcido alrededor de la punción (actividad antibacteriana negativa de BAL frente a S. Tiphymurium) y el 23,5% de las BAL no logró crecer en el tiempo estándar (Figura 1.A.).Teniendo en cuenta el potencial de inhibición de cada BAL frente a las cuatro cepas de S. Tiphymurium, el 53% presentó halos frente a todas las cepas de S. Tiphymurium, el 8% a tres de ellas, el 6% inhibió dos, el 5% inhibió una y el 28% no inhibió ninguna (Figura 1.B). A partir de estos resultados fueron seleccionadas treinta cepas con el mejor potencial antibacteriano(halo de al menos 10 mm) para ser identificadas mediante análisis de secuencia del ADN ribosómico 16S. De la totalidad de los aislamientos analizados, 24 presentaron una homología del 98 al 100% con géneros y especies de BAL, las 6 restantes no lograron ser identificadas. Las especies prevalentes fueron: Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactococcus lactis subsp. hordniae, Lactobacillus nantensis, Lactobacillus plantarum y Lactobacillus pentosus. La caracterización fenotípica y genotípica y la potencial capacidad inhibitoria de las BAL, representa uno de los primeros pasos en la identificación de cepas probióticas. Los resultados de este trabajo serán la base de estudios de caracterización probiótica y tecnológica de las cepas BAL candidatas para el desarrollo de alimentos seguros elaborados con leche cruda. Figura 1: Ensayo de difusión en agar. A. Porcentaje de BAL productoras de halo de inhibición (BAL Positivas), no productoras de halo de inhibición (BAL Negativas) y sin crecimiento en el tiempo estándar (S/C). B. Porcentaje de BAL con potencial inhibitorio frente a cuatro, tres, dos y una cepa de S. Tiphymurium.1-González-de la Cruz, J. U., Rodríguez-Palma, J. J. J., Escalante-Herrera, K. S., de la Torre Gutiérrez, L., Pérez-Morales, R., de la Cruz-Leyva, M. C. (2021). Identificación genética de bacterias ácido lácticas nativas en leche cruda de vaca y queso Poro artesanal. Manglar, 18, 7-13.2-Ghahremani, E., Mardani, M., Rezapour, S. (2015). Phenotypic and genotypic characterization of lactic acid bacteria from traditional cheese in Khorramabad city of Iran with probiotic potential. AppliedBiochemistry and Biotechnology, 175: 2516-2527.3-Speranza, B., Bevilacqua, A., Corbo, M.R., Altieri, C. y Sinigaglia, M. (2015). Selection of autochthonous strains as promising starter cultures for Fior di Latte, a traditional cheese of southern Italy, Journal of Science and Food Agriculture, 95, 88-97. 4-Di Grigoli, A.N., Francesca, N., Gaglio, R., Guarrasi, V., Moschetti, M., Scatassa, M. L., Settanni, L., Bonanno, A. (2015). The influence of the wooden equipment employed for cheese manufacture on the characteristics of a traditional stretched cheese during ripening. Food Microbiology, 46, 81-91.