? Efecto de la toxina HlyA sobre la homeostasis del ATP extracelular en glóbulos rojo

SACERDOTI MARIANA; M. F. LEAL DENIS; MATE, SABINA; HERLAX, VANESA; SCHWARZBAUM P.J; ESPELT M.V

Congreso; SAFIS; 2016

El ATP y otros nucleótidos actúan como moléculas de señalización extracelular, actuando sobre receptores purinérgicos autócrina y/o parácrinamente. Esta señalización es modulada por ectonucleotidasas, enzimas que hidrolizan e interconvierten nucleótidos en el espacio extracelular.Trabajos previos demostraron que la toxina alfa hemolisina (HlyA) secretada por cepas uropatogénicas de E. coli inducen la hemólisis por activación de los receptores purinérgicos P2X7. Además, la toxina en el lumen vascular promueve un desbalance osmótico en h-RBCs (glóbulos rojos humanos), induciendo cambios dinámicos en el volumen celular (Vr) asociados a una activación de la salida de ATP, generando un aumento en la concentración de ATP extracelular ([ATPe]). Es por ello que nos proponemos estudiar el efecto de HlyA de E. coli sobre cambios dinámicos en [ATPe] y Vr de h-RBCs, tanto en presencia como ausencia de adhesión a poli-D-lisina. También se determinó la viabilidad celular para evaluar el componente lítico de la salida de ATP.Células adheridas fueron incubadas con 200 ng/ml, 350 ng/ml o 400 ng/ml de HlyA. Se utilizó microscopía de fluorescencia para medir Vr y viabilidad, y luciferina-luciferasa para medir ATPe por luminiscencia. Se observó que en los primeros minutos, a todas las concentraciones de HlyA utilizadas, las células sufrieron una disminución del Vr que luego tornó hacia valores controles iniciales. Posteriormente el Vr aumentó paulatinamente hasta el final del experimento junto con el aumento de la muerte celular y de [ATPe]. Es destacable que se observa aumento de [ATPe] en ausencia de hemólisis (100% viabilidad), indicando un componente no lítico de la salida de ATP. Cuando las células fueron incubadas con CBX (un inhibidor de la salida de ATP por panexina) en presencia de HlyA, la hemólisis observada fue menor y la acumulación de [ATPe] también.Con el fin de aproximarnos a condiciones in vivo utilizamos h-RBCs en suspensión a hematocrito 10% y a 37°C. Se realizaron medidas simultáneas de [ATPe] (luminiscencia) y hemólisis (espectrofotometría). Los h-RBC fueron incubados en presencia o ausencia de HlyA (5ug/ml) durante 5 y 10 min. La presencia de la toxina indujo un aumento de [ATPe] mayor al 200% con respecto al control.Nuestros resultados indican que la HlyA induce el aumento de ATPe no lítico y lítico en h-RBCs, asociado a cambios dinámicos de Vr. La inhibición de la salida de ATP por CBX protegería a las células de la hemólisis.