RELEVANCIA CATALÍTICA Y ESTRUCTURAL DE RESIDUOS PERTENECIENTES AL SITIO ACTIVO DE LA ENZIMA NITRITO REDUCTASA DE COBRE

CRISTALDI J.C.; DURÉ, A.; RIVAS, MARÍA G.; DALOSTO, S.D; GONZALEZ, PABLO; MONTICH, G.; BRONDINO, C. D.

Congreso; XII Congreso Argentino de Fisicoquímica y Química Inorgánica; 2021

La nitrito reductasa (NirK) cataliza la reducción de nitrito a óxido nítrico en el ciclobiogeoquímico del nitrógeno. La NirK de Sinorhizobium meliloti 2011 (SmNirK), es unaproteína homotrimérica que contiene en cada monómero dos centros de Cu, uno detipo 1 (T1Cu) y otro de tipo 2 (T2Cu).1 El T1Cu es un centro de transferenciaelectrónica (TE) y el T2Cu es el sitio activo de la enzima. El T2Cu se encuentra en elinterior de la estructura de la proteína y en la interfaz de dos monómeros. De las tresHis que coordinan al Cu del T2Cu, la His342 es la única que pertenece al monómeroadyacente.2 Este residuo podría ser clave en la estabilidad estructural de la proteína.El Glu135 es un residuo cercano al T2Cu y dada su naturaleza electrostática podríatener influencia en el potencial de reducción del centro activo.Resultados. Se obtuvieron dos variantes de SmNirK a partir de la sustitución de laHis342 por una Gly (H342G) y del Glu315 por una Ala (E315A). Las variantes poseenuna estructura trimérica similar a SmNirK. Ambas proteínas incorporaron Cu en los dossitios. En los espectros UV-vis y EPR se observa que solo el T2Cu sufre levesmodificaciones. E315A presenta actividad catalítica similar a SmNirK, mientras queH342G presenta actividad muy baja. Ensayos de EPR demostraron que la TE T1 a T2y la reducción del sustrato ocurren en E315A y es no detectable en H342G. Ensayosde reducción/oxidación de E315A monitoreados por EPR evidencia una variación en elEo? del sitio T2Cu.Se estudió la estabilidad de SmNirk y de la variante H342G mediante estudioscalorimétricos. Se evaluó la contribución de His342 en la estabilidad estructural de laproteína.Conclusiones.Las mutaciones no alteraron la estructura cuaternaria de la proteína. Ambas variantespresentan los dos sitios de Cu intactos. La baja actividad catalítica de H342G podríadeberse a una TE deficiente entre los sitios y alteraciones del T2Cu. La mutación delresiduo Glu315 no afecta la actividad catalítica de la enzima pero modifica el Eo? delT2Cu.Referencias1) Ferroni, F., M., et al. J. Inorg. Biochem, 2012, 114,8-14.2) Cristaldi, J., C., et al. BBA, 2018, 1862, 752-760.