Detección de Fasciola hepatica mediante PCR en Lymnaea sp con infección natural

MARCELA CUCHER; SILVANA CARNEVALE; LUCILA PREPELITCHI; CRISTINA WISNIVESKY

Florianópolis, Santa Catarina, Brasil

Congreso; XLI Congreso da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical – I Encontro de Medicina Tropical do Cono Sul; 2005

DETECCIÓN DE Fasciola hepatica MEDIANTE PCR EN Lymnaea sp CON INFECCION NATURAL Marcela Cucher1,2, Silvana Carnevale1, Lucila Prepelitchi2, Cristina Wisnivesky2. 1Departamento de Parasitología, INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”. Av. Vélez Sársfield 563, (CP 1281), Buenos Aires, Argentina 2Unidad de Ecología de Reservorios y Vectores de Parásitos, FCEN, UBA. Intendente Güiraldes 2160Ciudad Universitaria, C1428EGA, Buenos Aires, Argentina. Introducción: Fasciola hepatica (Trematoda: Digenea) es el agente etiológico de la fasciolosis, zoonosis cosmopolita de gran importancia económica para la ganadería. Este parásito completa su ciclo biológico utilizando como hospederos intermediarios caracoles del género Lymnaea y se desarrolla sexualmente en vertebrados herbívoros. Conocer la prevalencia de infección en caracoles es un paso clave para comprender la dinámica de transmisión del parásito. La determinación taxonómica del parásito se basa en la morfología de las cercarias ya que los estadíos de desarrollo tempranos (redias y esporoquistes) comparten características con trematodes de la misma familia (Echinostomatidae). La técnica de PCR constituye una herramienta útil para la detección de infecciones precoces de F. hepatica en caracoles Lymanea sp. naturalmente infectados. Objetivo: Desarrollar un método molecular para la identificación de F. hepatica en hospederos intermediarios. Material: Se recolectaron muestras de caracoles en dos provincias de Argentina. La Muestra 1 (240 caracoles identificados como L. columella) se coleccionó en cuerpos de agua dentro de un establecimiento con ganado infectado en Corrientes y la Muestra 2 (34 caracoles identificados como L. viatrix) en cuerpos de agua elegidos al azar en San Luis. Métodos: La presencia del parásito en todos los caracoles se determinó primero por microscopía óptica y luego por PCR. La purificación de ADN se realizó siguiendo protocolos estándar de lisis proteolítica, extracción fenólica, precipitación etanólica y remoción de inhibidores. Todas las muestras se procesaron por la técnica de PCR empleando un par de primers diseñado sobre la secuencia del gen mitocondrial de la enzima citocromo oxidasa I de F. hepatica para amplificar un fragmento de 405 pb. Para verificar la especificidad de la reacción se emplearon los siguientes controles: ADN de L. columella y L. viatrix no infectados y ADN de otros trematodes que utilizan estos caracoles como hospedero intermediario. Se estableció el límite de detección utilizando ADN cuantificado de F. hepatica en la presencia  ADN de caracoles. Resultados: Muestra 1: La prevalencia de infección por trematodes registrada por microscopía óptica fue de 17.5% (42/240). En el 5%(12/240) de los caracoles se identificaron cercarias de F. hepatica. La técnica de PCR reveló un 50.4% (121/240) de infección. El 97.6% (41/42) de las muestras positivas por microscopía también lo fue por PCR y el 66.1% (80/121) de las muestras positivas por PCR no fue detectado por microscopía. Muestra 2: Por observación directa se hallaron 2 caracoles infectados por redias inmaduras (5.9%), mientras que la PCR permitió detectar un 61.8% (21/34) de ejemplares positivos para F. hepatica, incluyendo los dos detectados por microscopía. En el ensayo de especificidad no se obtuvieron productos de amplificación cuando el ADN muestra pertenecía a los distintos trematodes y a L. columella y L. viatrix. El límite de detección de la técnica de PCR resultó ser de 100 pg de ADN de F. hepatica. Conclusión: El método desarrollado presenta ventajas sustantivas sobre el análisis parasitológico directo debido a que: 1) mostró alta especificidad a la infección por F. hepatica en caracoles ya que no se observaron reacciones cruzadas con otros trematodes y 2) alta sensibilidad ya que permitiría detectar los primeros estadíos larvales que infectan al caracol. Las diferencias significativas en cuanto a las tasas de infección calculadas por ambos métodos muestran que la técnica de PCR puede aportar datos más realistas sobre el verdadero nivel de infección en caracoles en la naturaleza y su correspondiente impacto en la ganadería y en la salud humana.