Aspectos estructurales y funcionales de la interacción alfa-amilasa con el polielectrolito aniónico poliacrilato (PAA).

PORFIRI, MA. CECIIA; BRINATTI ANTONIO, CESAR; FARRUGGIA, BEATRIZ; LOH, WATSON; ROMANINI, DIANA

Córdoba

Congreso; XVII Congreso Argentino de Fisicoquímica y Química Inorgánica. Organizado por la Asociación Argentina de Investigación Fisicoquímica; 2011

XVII Congreso Argentino de Fisicoquímica y Química Inorgánica. Organizado por la Asociación Argentina de Investigación Fisicoquímica

ASPECTOS ESTRUCTURALES Y FUNCIONALES DE LA INTERACCIÓN ALFA-AMILASA CON EL POLIELECTROLITO ANIÓNICO POLIACRILATO (PAA). María Cecilia Porfiria, César Brinatti Antoniob, Beatriz Farruggiaa, Watson Lohb, Diana Romaninia. a, César Brinatti Antoniob, Beatriz Farruggiaa, Watson Lohb, Diana Romaninia. aLab. de Fisicoquímica Aplicada a Bioseparación. Fac. de Cs. Bioquímicas y Farm. Universidad Nacional de Rosario – CONICET. bInstituto de Química. Univ. Estadual de Campinas (UNICAMP). Campinas, SP. Brasil. mariacecilia_998@hotmail.com Lab. de Fisicoquímica Aplicada a Bioseparación. Fac. de Cs. Bioquímicas y Farm. Universidad Nacional de Rosario – CONICET. bInstituto de Química. Univ. Estadual de Campinas (UNICAMP). Campinas, SP. Brasil. mariacecilia_998@hotmail.com Introducción: La interacción proteínas/polielectrolitos ha sido objeto de estudio en los últimos años como herramienta útil para múltiples aplicaciones. La enzima alfa-amilasa (-Amy) producida por el hongo Aspergillus oryzae es ampliamente utilizada en diversas ramas industriales y ha demostrado interaccionar fuertemente con el polielectrolito PAA (240kDa) a pH ácido (3,00) [1]. En este trabajo se ha profundizado en el estudio de dicha interacción a través de técnicas de dicroísmo circular (DC) y calorimetría diferencial de barrido (DSC), las cuales permiten evaluar el estado estructural y la estabilidad térmica de la proteína, respectivamente, al interaccionar con el polímero. Por otro lado, se ha analizado el efecto de esta interacción sobre la cinética de inactivación ácida de la enzima y el posible efecto estabilizador del PAA. La interacción proteínas/polielectrolitos ha sido objeto de estudio en los últimos años como herramienta útil para múltiples aplicaciones. La enzima alfa-amilasa (-Amy) producida por el hongo Aspergillus oryzae es ampliamente utilizada en diversas ramas industriales y ha demostrado interaccionar fuertemente con el polielectrolito PAA (240kDa) a pH ácido (3,00) [1]. En este trabajo se ha profundizado en el estudio de dicha interacción a través de técnicas de dicroísmo circular (DC) y calorimetría diferencial de barrido (DSC), las cuales permiten evaluar el estado estructural y la estabilidad térmica de la proteína, respectivamente, al interaccionar con el polímero. Por otro lado, se ha analizado el efecto de esta interacción sobre la cinética de inactivación ácida de la enzima y el posible efecto estabilizador del PAA. Objetivos: 1- Analizar la influencia del PAA en el contenido de estructuras secundarias de la proteína a través de espectros de DC. 2- Evaluar la estabilidad térmica de la enzima en ausencia y presencia del polímero a través del análisis de los termogramas obtenidos por DSC. 3- Determinar los parámetros cinéticos correspondientes al proceso de inactivación ácida de la enzima en presencia de PAA. 1- Analizar la influencia del PAA en el contenido de estructuras secundarias de la proteína a través de espectros de DC. 2- Evaluar la estabilidad térmica de la enzima en ausencia y presencia del polímero a través del análisis de los termogramas obtenidos por DSC. 3- Determinar los parámetros cinéticos correspondientes al proceso de inactivación ácida de la enzima en presencia de PAA. Resultados: Para los análisis estructurales se trabajó con soluciones de -Amy a pH 3,00 en presencia de distintas concentraciones de PAA. Los espectros de DC mostraron cierta disminución en su intensidad al incrementarse la relación PAA/-Amy, indicando una leve modificación en el contenido de estructura secundaria de la enzima. Los termogramas obtenidos por DSC indicaron la presencia de dos transiciones de la proteína con temperaturas de melting correspondientes a 331K y 343K, las cuales no se vieron significativamente afectadas ante la presencia de PAA (330 y 341K, respectivamente). Las entalpías calorimétricas obtenidas para cada transición indicaron mayor interacción del PAA con el segundo dominio estructural de la enzima. Por último, el seguimiento de la actividad catalítica de la -Amy luego de distintos períodos de incubación a pH 3,00 en presencia de PAA permitió concluir, a través del ajuste matemático de los datos, una cinética de inactivación de primer orden, tal como ha sido sugerida para la enzima sola [2], con una constante de velocidad que decae de 0,022min-1 (-Amy) a 7,7e-3min-1 (-Amy+PAA). Para los análisis estructurales se trabajó con soluciones de -Amy a pH 3,00 en presencia de distintas concentraciones de PAA. Los espectros de DC mostraron cierta disminución en su intensidad al incrementarse la relación PAA/-Amy, indicando una leve modificación en el contenido de estructura secundaria de la enzima. Los termogramas obtenidos por DSC indicaron la presencia de dos transiciones de la proteína con temperaturas de melting correspondientes a 331K y 343K, las cuales no se vieron significativamente afectadas ante la presencia de PAA (330 y 341K, respectivamente). Las entalpías calorimétricas obtenidas para cada transición indicaron mayor interacción del PAA con el segundo dominio estructural de la enzima. Por último, el seguimiento de la actividad catalítica de la -Amy luego de distintos períodos de incubación a pH 3,00 en presencia de PAA permitió concluir, a través del ajuste matemático de los datos, una cinética de inactivación de primer orden, tal como ha sido sugerida para la enzima sola [2], con una constante de velocidad que decae de 0,022min-1 (-Amy) a 7,7e-3min-1 (-Amy+PAA). Conclusiones: La formación de complejos -Amy/PAA ha demostrado alterar el contenido de estructuras secundarias de la proteína sin modificación significativa en la estabilidad térmica de la misma. Aún así, ha mejorado notablemente la estabilidad funcional de la enzima al pH correspondiente al de mayor interacción entre ambos componentes (3,00). Estos resultados permiten ampliar el conocimiento de este sistema proyectando una potencial metodología de concentración y/o aislamiento de la proteína. La formación de complejos -Amy/PAA ha demostrado alterar el contenido de estructuras secundarias de la proteína sin modificación significativa en la estabilidad térmica de la misma. Aún así, ha mejorado notablemente la estabilidad funcional de la enzima al pH correspondiente al de mayor interacción entre ambos componentes (3,00). Estos resultados permiten ampliar el conocimiento de este sistema proyectando una potencial metodología de concentración y/o aislamiento de la proteína. Referencias bibliográficas: [1] M. C. Porfiri, G. Picó, B. Farruggia, D. Romanini. (2010), Process Biochemistry, 45, 1753-1756. [2] M. Carlsen, J. Nielsen, J. Villadsen. (1995). Chemical Engineering Science, 51, 37-43. 45, 1753-1756. [2] M. Carlsen, J. Nielsen, J. Villadsen. (1995). Chemical Engineering Science, 51, 37-43. 51, 37-43.