INVESTIGADORES
ROMANINI Diana
congresos y reuniones científicas
Título:
Aislamiento de lipasa desde caldos de cultivo en medio sólido.
Autor/es:
MARINI, ANALÍA; IMELIO, NATALIA; ROMANINI, DIANA; FARRUGGIA, BEATRIZ
Lugar:
Córdoba
Reunión:
Congreso; XVII Congreso Argentino de Fisicoquímica y Química Inorgánica. Organizado por la Asociación Argentina de Investigación Fisicoquímica; 2011
Institución organizadora:
Asociación Argentina de Investigacion Fisicoquímica
Resumen:
AISLAMIENTO DE LIPASA DESDE CALDOS DE CULTIVO EN MEDIO SÓLIDO UTILIZANDO SISTEMAS BIFÁSICOS ACUOSOS. UTILIZANDO SISTEMAS BIFÁSICOS ACUOSOS. Marini, Analía; Imelio, Natalia; Romanini, Diana y Farruggia, Beatriz. Lab. Fisicoquímica Aplicada a la Bioseparación. Fac. Cs. Bioquímicas y Farmacéuticas. U.N.R. FONCYT. CONICET. CIUNR. analia_marini@yahoo.com.ar El desarrollo de métodos económicos y eficientes para la extracción y purificación de grandes cantidades de enzimas (downstream processing) desde sus fuentes naturales o de microorganismos donde se expresen es fundamental en procesos industriales. La mayoría de las enzimas de alto valor industrial no son producidas en el país. Una metodología bioseparativa es la aplicación de los sistemas bifásicos acuosos (SBA) sobre los medios naturales, complejos en sí mismos, para aislar la enzima de interés de los contaminantes. Los SBA se forman por la mezcla, favorecida termodinámicamente, de soluciones de dos polímeros de cadena flexible o de un polímero y una sal. Permiten el reparto selectivo de proteínas u otros componentes celulares entre ambas fases. Las lipasas de origen microbiano son mucho más diversas en sus propiedades enzimáticas y en la especificidad de sustrato, lo cual las convierte en valiosos catalizadores con diferentes usos industriales, entre los que se destacan la industria alimenticia, del papel y su uso como aditivo en la formulación de detergentes. En este trabajo hemos realizado estudios básicos con la enzima purificada comercialmente para hallar las condiciones óptimas de separación que puedan ser aplicadas sobre un caldo de cultivo. Se efectuó una caracterización del perfil de reparto de lipasa de un liofilizado comercial en SBAs formados por polietilenglicoles (PEG) de diferentes masas molares (MM: 1000-8000) y sales: fosfato de potasio (Pi) pH: 7,00 y citrato de sodio (Ci) a pH 5,2 y pH 8,2. Además se llevó a cabo el análisis de las funciones termodinámicas del proceso de reparto realizando las experiencias a dos temperaturas diferentes para conocer el tipo de interacciones involucradas entre las enzimas y las fases donde se recuperan complementándolos con espectros de dicroísmo circular (DC), espectroscopía de fluorescencia y mediciones de actividad enzimática en las diferentes fases de los SBA. Los resultados indican que los mejores sistemas para recuperar la lipasa son los sistemas PEG1000/Pi pH 7,0, PEG2000/Ci y PEG4000/Ci pH 5,2 y PEG2000/Ci pH 8,2 con altos factores de purificación (FP) y rendimientos (R). En los SBA compuestos por Ci la lipasa se reparte hacia la fase inferior con resultados similares a pH 5,2 y pH 8,2, indicando que la carga de la proteína no es un factor determinante del reparto. En el sistema PEG1000/Pi pH 7 el coeficiente de reparto presentó un valor mucho mayor a la unidad indicando que la enzima se reparte hacia la fase rica en polímero. El tipo de interacciones enzima-PEG son de tipo electrostáticas o hidrofóbicas entre la enzima y los PEG dependiendo de la MM del PEG y la sal. El PEG produce modificación de la estructura terciaria a nivel del sitio activo de la enzima. Esto último comprobado por mediciones de actividad enzimática y quenching de fluorescencia con acrilamida. Por medidas de DC se observa que el PEG de masa molar 4000 no produce cambios significativos de la estructura secundaria de la enzima. La producción de lipasa de Aspergillus niger NRRL3 se llevó a cabo en sistemas de cultivo en medio sólido (CMS) y fueron comparados con cultivos en medio líquidos sumergidos (MLS). Los SBA seleccionados aplicados a los caldos de cultivo muestran R mayores para los CMS que para los MLS y para los sistemas PEG/Ci (96%) que para los PEG/Pi (85%). El sistema PEG4000/Ci pH 5,2 resulta ser el único sistema con alto rendimiento y purificación. Esta metodología permitiría un primer paso extractivo de lipasas desde medios de cultivos fúngicos de producción sencilla (CMS) con menos perjuicio sobre el medio ambiente (Ci). downstream processing) desde sus fuentes naturales o de microorganismos donde se expresen es fundamental en procesos industriales. La mayoría de las enzimas de alto valor industrial no son producidas en el país. Una metodología bioseparativa es la aplicación de los sistemas bifásicos acuosos (SBA) sobre los medios naturales, complejos en sí mismos, para aislar la enzima de interés de los contaminantes. Los SBA se forman por la mezcla, favorecida termodinámicamente, de soluciones de dos polímeros de cadena flexible o de un polímero y una sal. Permiten el reparto selectivo de proteínas u otros componentes celulares entre ambas fases. Las lipasas de origen microbiano son mucho más diversas en sus propiedades enzimáticas y en la especificidad de sustrato, lo cual las convierte en valiosos catalizadores con diferentes usos industriales, entre los que se destacan la industria alimenticia, del papel y su uso como aditivo en la formulación de detergentes. En este trabajo hemos realizado estudios básicos con la enzima purificada comercialmente para hallar las condiciones óptimas de separación que puedan ser aplicadas sobre un caldo de cultivo. Se efectuó una caracterización del perfil de reparto de lipasa de un liofilizado comercial en SBAs formados por polietilenglicoles (PEG) de diferentes masas molares (MM: 1000-8000) y sales: fosfato de potasio (Pi) pH: 7,00 y citrato de sodio (Ci) a pH 5,2 y pH 8,2. Además se llevó a cabo el análisis de las funciones termodinámicas del proceso de reparto realizando las experiencias a dos temperaturas diferentes para conocer el tipo de interacciones involucradas entre las enzimas y las fases donde se recuperan complementándolos con espectros de dicroísmo circular (DC), espectroscopía de fluorescencia y mediciones de actividad enzimática en las diferentes fases de los SBA. Los resultados indican que los mejores sistemas para recuperar la lipasa son los sistemas PEG1000/Pi pH 7,0, PEG2000/Ci y PEG4000/Ci pH 5,2 y PEG2000/Ci pH 8,2 con altos factores de purificación (FP) y rendimientos (R). En los SBA compuestos por Ci la lipasa se reparte hacia la fase inferior con resultados similares a pH 5,2 y pH 8,2, indicando que la carga de la proteína no es un factor determinante del reparto. En el sistema PEG1000/Pi pH 7 el coeficiente de reparto presentó un valor mucho mayor a la unidad indicando que la enzima se reparte hacia la fase rica en polímero. El tipo de interacciones enzima-PEG son de tipo electrostáticas o hidrofóbicas entre la enzima y los PEG dependiendo de la MM del PEG y la sal. El PEG produce modificación de la estructura terciaria a nivel del sitio activo de la enzima. Esto último comprobado por mediciones de actividad enzimática y quenching de fluorescencia con acrilamida. Por medidas de DC se observa que el PEG de masa molar 4000 no produce cambios significativos de la estructura secundaria de la enzima. La producción de lipasa de Aspergillus niger NRRL3 se llevó a cabo en sistemas de cultivo en medio sólido (CMS) y fueron comparados con cultivos en medio líquidos sumergidos (MLS). Los SBA seleccionados aplicados a los caldos de cultivo muestran R mayores para los CMS que para los MLS y para los sistemas PEG/Ci (96%) que para los PEG/Pi (85%). El sistema PEG4000/Ci pH 5,2 resulta ser el único sistema con alto rendimiento y purificación. Esta metodología permitiría un primer paso extractivo de lipasas desde medios de cultivos fúngicos de producción sencilla (CMS) con menos perjuicio sobre el medio ambiente (Ci). Aspergillus niger NRRL3 se llevó a cabo en sistemas de cultivo en medio sólido (CMS) y fueron comparados con cultivos en medio líquidos sumergidos (MLS). Los SBA seleccionados aplicados a los caldos de cultivo muestran R mayores para los CMS que para los MLS y para los sistemas PEG/Ci (96%) que para los PEG/Pi (85%). El sistema PEG4000/Ci pH 5,2 resulta ser el único sistema con alto rendimiento y purificación. Esta metodología permitiría un primer paso extractivo de lipasas desde medios de cultivos fúngicos de producción sencilla (CMS) con menos perjuicio sobre el medio ambiente (Ci).