INVESTIGADORES
ROMANINI Diana
congresos y reuniones científicas
Título:
COMPARACIÓN DE LA EFICIENCIA ENTRE DOS METODOLOGÍAS BIOSEPARATIVAS EN EL AISLAMIENTO DE -AMILASA FÚNGICA
Autor/es:
PORFIRI, MA. CECIIA; PICÓ, GUILLERMO; FARRUGGIA, BEATRIZ; ROMANINI, DIANA
Lugar:
Rosario
Reunión:
Simposio; 1er Simposio Argentino de los Procesos Biotecnológicos; 2010
Institución organizadora:
Laboratorio de Fisicoquímica Aplicada a Bioseparación
Resumen:
Introducción.              La utilización de polímeros de cadena flexible (PCF) en procesos de bioseparación de proteínas incluye varios métodos novedosos como partición en sistemas bifásicos acuosos (SBA) y precipitación por formación de complejos polielectrolitos-proteínas.             El primero se basa en el principio de reparto de proteínas en sistemas bifásicos acuosos los cuales se forman cuando: a) se mezclan en medio acuoso dos polímeros de cadena flexible (PCF) o bien un PCF y una sal (fosfato de potasio, sulfato de sodio etc.) por encima de una cierta concentración crítica (sistemas preformados). En este caso espontáneamente se originan dos fases, una rica en uno de los polímeros y la otra rica en el otro polímero o la sal, b) se calienta una solución de PCF por encima de cierta temperatura crítica (sistemas inducidos por la temperatura), una de las fases está enriquecida en el polímero y la otra está muy empobrecida en el mismo. Diversas macromoléculas tales como proteínas y ácidos nucleicos se reparten entre las dos fases acuosas de acuerdo a un coeficiente de reparto, Kr que se define como el cociente entre la concentración de la proteína en la fase superior y la fase inferior y depende tanto de las características de la biomolécula que se reparte (peso molecular, carga, hidrofobicidad superficial, etc.) como de aquellas propias del SBA empleado (tipo, peso molecular y concentración del PCF, pH, fuerza iónica, presencia de iones liotrópicos, temperatura, etc.). Consecuentemente la elección de las condiciones experimentales adecuadas permitirá emplear los SBA para extraer una proteína blanco de una mezcla compleja, haciendo que dicha molécula se reparta mayoritariamente hacia una de las fases y las que constituyen sus impurezas hacia la fase contraria.             El segundo método incluye a los PCF que poseen carga eléctrica neta, denominados comúnmente polielectrolitos (PE), forman complejos con las proteínas, los cuales pueden volverse insolubles, pudiendo separarse del resto del medio por simple decantación. Este proceso depende de una serie de variables experimentales tales como: diferente densidad de carga eléctrica y peso molecular y pK del PE, pH, presencia de aniones polivalentes, fuerza iónica, concentración del PE, etc. Para que el proceso sea efectivo, se debe lograr que la proteína pueda ser recuperada del complejo insoluble. Esto es posible si se encuentran las condiciones para que el complejo pueda disociarse, regenerando la proteína con su actividad biológica y, por otro lado, reciclando el PE para un nuevo proceso. El empleo de la precipitación con PE  tiene, al igual que los SBA la ventaja de su simplicidad y rapidez en la separación del complejo proteína-PE, el bajo costo y la posibilidad de aplicarse a gran escala ya que los PE son realmente económicos, no requiere de instrumental complicado, se reduce en forma sustancial el volumen de la solución donde se encuentra contenida la proteína de interés y el proceso se puede llevar a cabo en un fermentador, donde un microorganismo este produciendo la proteína que luego es recuperada como fase sólida. Una adecuada descripción empírica de estos sistemas permite aplicar estas metodologías sobre extractos naturales para ser aplicados a escala industrial.             La alfa-amilasa es una proteína de gran importancia en la industria alimenticia, textil y cervecera. El presente trabajo tuvo como objetivo comparar la eficiencia de ambas metodologías para purificar alfa-amilasa de una fuente natural: el páncreas porcino.   Métodología: Metodología utilizando sistemas bifásicos acuosos (SBA): se preparación de los sistemas bifásicos acuosos por mezcla de soluciones salinas y soluciones de diversos PEG de pesos moleculares, a diferentes composiciones del sistema y a dos temperaturas (8°C y 36°). A cada uno de estos sistemas se les añadió alfa-amilasa purificada y, luego de alcanzado el equilibrio de reparto, se procedió a la cuantificación de la proteína en cada fase para calcular los coeficientes de reparto (Kr) en los diversos sistemas. Con estos resultados se seleccionaron los sistemas y las condiciones más adecuadas para el ensayo del reparto de alfa-amilasa de homogenado de páncreas bovino. Metodología utilizando precipitación con polielectrolitos:             En primer lugar se realizaron diagramas de solubilidad a diferentes relaciones molares de polímero/proteína y se analizaron los rangos de pH para los cuales el complejo es insoluble utilizando alfa-amilasa purificada. Los mismos diagramas se repitieron en presencia de fuerzas iónicas crecientes. Se ensayó la precipitación y se separó el sobrenadante del precipitado. El precipitado se redisolvió con un buffer fosfato de sodio pH 6,0. Se determinó la actividad enzimática y el contenido de alfa-amilasa a cada una de estas fracciones. El mismo procedimiento se realizó sobre la proteína purificada y sobre el homogenado de páncreas. Por último se calcularon el rendimiento (R) y el factor de purificación (FP) de alfa-amilasa pancreática aplicando ambas metodologías.   Resultados.             De los SBA preparados con diferentes PEG-fosfato de potasio para aislar alfa-amilasa se observó que los sistemas PEG 2.000-fosfato de potasio y PEG 8.000-fosfato de potasio resultaron ser los más eficientes para aislar alfa-amilasa purificada a temperatura ambiente. Los valores de los coeficientes de reparto mayores a 1 indicaron que la proteína tiende a enriquecer la fase rica en el polímero. Para los dos sistemas, los valores de cambio entálpico y entrópico del proceso de reparto resultaron ambos negativos, lo cual indica que el mismo estaría conducido entálpicamente. El análisis de la purificación demuestra que el sistemas PEG 8.000-fosfato de potasio no resultó eficiente para la obtención de la alfa-amilasa a partir del extracto pancreático a temperatura ambiente. En cambio, el sistema PEG 2.000-fosfato de potasio, arrojó resultados que demostraron un buen rendimiento pero una escasa purificación: R = 71,02%, FP = 1,106. Los diagramas de solubilidad de los complejos alfa-amilasa/poliacrilato mostraron que éstos son insolubles a pHs menores a 4,0 y que la relación molar de precipitación fue de154 moles de alfa-amilasa por mol de PAA. El cambio de fuerza iónica del medio no fue suficiente para redisolver el precipitado. Esto estaría demostrando que la interacción entre la proteína no es únicamente conducida por la interacción electrostática. Para la redisolución del precipitado se recurrió a la adición de buffer pH 6,0 lo cual presenta la ventaja extra de ser el pH óptimo de actividad enzimática de alfa-amilasa. Cuando el procedimiento se aplicó a un homogenado de páncreas bovino, el FP obtenido fue de 2,6 y el R de 79,20%.   Conclusiones.             Comparando estas dos metodologías entre sí se puede observar que la purificación de alfa-amilasa resulta más favorable al emplear precipitación con el poliacrilato. Si bien el rendimiento de ambas metodologías es muy bueno y similar, el factor de purificación obtenido a través del reparto en SBAs demuestra que no hay purificación.             El FP obtenido por precipitación, si bien no es muy elevado (2,6) hay que considerar que el mismo se obtuvo en un único paso de modo simple y rápido lo que convierte a esta metodología en altamente eficiente..