FORMACIÓN DE COMPLEJOS INSOLUBLES ENTRE TRIPSINA Y POLIVINIL SULFONATO COMO PUNTO DE PARTIDA DE DIVERSAS APLICACIONES BIOTECNOLOGICAS.

BRAIA, MAURICIO; LOH, WATSON; PICÓ, GUILLERMO; ROMANINI, DIANA

Salta

Congreso; XVI Congreso Argentino de Fisicoquímica y Química Inorgánica; 2009

Asociación Argentina de Investigación Fisicoquímica

            La formación de complejos entre proteínas y polímeros de cadena flexible con carga eléctrica (polielectrolitos) posee diversas aplicaciones biotecnológicas como ser: la inmovilización de enzimas en un reactor, la bioseparación por precipitación de proteínas de una mezcla compleja (cultivo microbiano), la estabilización de enzimas, etc. La tripsina es considerada una proteína de alto valor comercial puesto que es utilizada en numerosos procesos industriales y biotecnológicos. Si se analizan las variables fisicoquímicas del medio que condicionan la formación de dichos complejos insolubles y se determinan las relaciones molares óptimas de precipitación y redisolución se pueden diseñar estrategias bioseparativas factibles de ser aplicadas a gran escala. Las técnicas más utilizadas para estudiar las variables del medio son: la turbidimetría, light-scattering, calorimetría de titulación isotérmica (ITC), etc. En cambio, para evaluar la integridad de la estructura tridimensional de la enzima se utilizan: determinación de la actividad catalítica, dicroísmo circular, calorimetría diferencial de barrido, etc.             El objetivo de nuestro trabajo fue determinar el mecanismo molecular de la interacción entre tripsina y un polielectrolito negativamente cargado: polivinilsulfonato de sodio (PVS) como herramienta para la separación de dicha proteína de un extracto natural: el páncreas porcino.             En trabajos anteriores se observó que el complejo TRP-PVS es insoluble a pH del medio menores a 5,0, con una relación molar mínima polímero/proteína de precipitación de 1:136. La presencia de una fuerza iónica de 0,5M no inhibe completamente la formación del complejo. La actividad enzimática de TRP en presencia del polímero se conservó a través del tiempo lo que demuestra un efecto protector y estabilizante de la estructura terciaria de la proteína. En este trabajo se determinaron las funciones termodinámicas calorimetría de titulación isotérmica las cuales corroboran la presencia de un predominio de interacciones electrostáticas. Las funciones termodinámicas obtenidas por ITC mostraron un DH° de interacción exotérmica (-35,8Kcal/mol) lo que indica un alto componente electrostático en la formación del complejo y un DS° negativo (-106,8 u.e.). La constante de afinidad del polímero por la proteína fue de 2,2 103 M-1 con un n de 47 moléculas de TRP/molécula PAA. La actividad enzimática de TRP se conservó en un 70% en presencia de un exceso de PVS, más aún, se mantuvo en un 64,08% a lo largo de 24hs a temperatura ambiente. Por ultimo se ensayaron las condiciones de precipitación estudiadas sobre un homogenado de páncreas porcino. Los resultados arrojaron un alto rendimiento de TRP en la fracción redisuelta (79,74%) y una buena estabilidad de la actividad biológica a través del tiempo lo que demuestra que el conocimiento del mecanismo molecular de la formación de complejos insolubles entre TRP y PVS es aplicable a procedimientos biotecnológicos industriales como la estabilización de enzimas o al recupero de esta proteína a partir de su fuente natural como a otras.