FORMACIÓN DE COMPLEJOS ENTRE LA ALFA-AMILASA DE Aspergillus oryzae Y POLIACRILATOS DE DIFERENTES PESOS MOLECULARES.

PORFIRI, MA. CECIIA; MARINI, ANALÍA; PICÓ, GUILLERMO; FARRUGIA, BEATRIZ; ROMANINI, DIANA

Salta

Congreso; XVI Congreso Argentino de Fisicoquímica y Química Inorgánica; 2009

Asociación Argentina de Investigación Fisicoquímica

Los polímeros de cadena flexible con carga eléctrica llamados comúnmente polielectrolitos (PE) forman complejos con proteínas, los cuales pueden ser solubles o insolubles de acuerdo a las condiciones del medio en que se encuentren. Esta conducta ha sido útil en el diseño de diversos procesos biotecnológicos tales como la inmovilización de enzimas, la bioseparación, la estabilización de la estructura terciaria  y en el desarrollo de nanotecnologías. Estos complejos pueden volverse insolubles cuando el PE y la proteína presentan cargas opuestas, pudiendo separarse del resto del medio por simple decantación. Las variables del medio que gobiernan dicho comportamiento son: pH, presencia de aniones polivalentes, fuerza iónica, etc. La enzima alfa-amilasa (aAmy) es una hidrolasa de gran importancia en la industria alimenticia, textil y cervecera. Esta proteína cataliza la hidrólisis de la cadena lineal y ramificada del almidón para formar una mezcla de dextrinas. Estas enzimas se consumen en gran cantidad con un variado grado de pureza y son empleadas en diferentes tipos de procesos industriales. El objetivo de este trabajo fue estudiar el mecanismo molecular y la cinética de formación de los complejos PAA-aAmy a través técnicas espectroscópicas y evaluar el estado conformacional de la enzima unida al polímero. En trabajos anteriores hemos determinado las relaciones molares de estos complejos con poliacrilato de dos pesos moleculares diferentes (240.000 y 100.000) las cuales demostraron que un gran número de moléculas de proteína se unen por molécula de PAA y que dicho valor depende fuertemente del peso molecular del polímero. En este trabajo se pudo observar una gran disminución en la intensidad de los espectros de fluorescencia de a-Amy en presencia del polímero sumado a un pequeño corrimiento hacia el azul, respecto de la enzima en buffer. Los estudios cinéticos permitieron determinar que el tiempo de interacción necesario para la formación del complejo insoluble (mayor turbidez del sistema), trabajando a las relaciones molares y pH óptimo previamente determinados, es de 40 segundos aprox., tiempo suficientemente corto como para afirmar que en este caso dicho proceso es rápido. En cuanto a la actividad biológica de la enzima, ésta mostró ser máxima a pH 5,0, inactivándose casi totalmente a pH 3,0 aunque de manera reversible. Además, al estar formando parte del complejo con poliacrilato no sólo mantiene sino que aumenta su actividad catalítica, con el mismo comportamiento reversible frente a la inactivación ácida. a-Amy también demostró ser estable en el tiempo en presencia del polímero, evidenciado por el mantenimiento relativamente constante de su actividad catalítica durante distintos períodos de incubación, arrojando a las 24 hs. una pequeña disminución de la misma del 14,4% y 8,5% con PAA 240.000 y 100.000, respectivamente, respecto de la actividad inicial. El conocimiento de los factores que afectan la precipitación de la enzima alfa-amilasa en dichos sistemas, es un gran aporte al diseño y optimización de esta técnica como proceso extractivo de aplicación a escala industrial.