Obtención de un hidrolizado proteico de amaranto por acción de una proteasa endógena. Su potencial actividad antitrombótica.

IBÁÑEZ MEDEROS SABRINA; ANA CLARA SABBIONE; ADRIANA ALICIA SCILINGO; MARÍA CRISTINA AÑÓN

Córdoba

Congreso; IV Congreso Internacional de Ciencia y Tecnología de Alimentos (CICYTAC 2012); 2012

Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba

El amaranto, pseudocereal de reconocidas ventajas agronómicas, contiene en sus semillas proteínas de alto valor nutricional y péptidos, que liberados mediante hidrólisis controlada poseen actividad biológica comprobada. Indicios de que se encuentra presente en los aislados de amaranto una proteasa endógena activa a pHs ácidos nos permiten establecer como objetivo del presente trabajo obtener un hidrolizado que, mediante la acción de dicha proteasa, contenga péptidos con potencial actividad antitrombótica. El aislado proteico fue obtenido a partir de harina de amaranto desgrasada (extracción a pH=9; precipitación isoeléctrica a pH=5). Para activar a la proteasa endógena se acidificaron dispersiones del aislado (20 mg/ml) con HCl, analizándose diferentes pHs (1,5; 2; 2,5; 3; 3,5 y 4), diferentes temperaturas de incubación (20; 29; 40; 55 y 65ºC), y diferentes tiempos de reacción (1; 3; 5; 7 y 16 horas), con el fin de determinar condiciones de máxima proteólisis. La reacción se detuvo calentando (95ºC, 10 min) o alcalinizando (NaOH). Se realizaron electroforesis SDS-PAGE o tricina-PAGE para definir la condición de hidrólisis y se determinó el grado de hidrólisis (GH) mediante la detección de los grupos amino libres con el reactivo OPA. Una vez establecidas las condiciones óptimas de reacción, se preparó el hidrolizado y se lo caracterizó determinando su composición y su perfil cromatográfico (FPLC de exclusión molecular, Superosa 6B HR, Amersham Biosciences, buffer fosfato 35 mM, pH 7,2). Por último, mediante el método de las microplacas se evaluó la potencial actividad antitrombótica. Los resultados electroforéticos mostraron que a pH 1,5; 2,0 y 2,5 la hidrólisis es importante mientras que a pH 3,0; 3,5 y 4,0 el perfil electroforético permanece similar al control, indicando que la proteasa no es activa en esas condiciones. Los resultados obtenidos permiten confirmar que en el aislado de amaranto se encuentra presente una proteasa, activa en un rango acotado de pHs ácidos y en un rango amplio de temperaturas, que genera péptidos de distintos pesos moleculares, en mayor número a mayores tiempos de incubación. El FPLC mostró picos a mayores tiempos de elución en el hidrolizado que en el aislado control, confirmando la reducción de tamaño de las especies proteicas. El GH%1 h= 0,9±0,3, mientras que resultó 5,3±0,4 a las 16 h. Se estableció la condición óptima de proteólisis: pH 2-40ºC-16 h. Al evaluar la actividad antitrombótica in vitro se encontró que el aislado control no presentó inhibición de la coagulación a ninguna de las concentraciones analizadas (determinadas por el método de Lowry), mientras que el hidrolizado presentó actividad inhibitoria a partir de 0,77 mg proteína/ml. En este caso la inhibición alcanzada fue dosis-dependiente y de la curva obtenida se calculó el IC50 (5,5 mg proteína/ml).