INVESTIGADORES
PETRUCCELLI Silvana
congresos y reuniones científicas
Título:
Incrementando la capacidad de síntesis de proteínas heterólogas en hojas de Nicotiana benthamiana mediante el uso de LEC2
Autor/es:
OCAMPO, CAROLINA GABRIELA; PETRUCCELLI, SILVANA
Lugar:
Posadas
Reunión:
Simposio; 6to Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos, SAPROBIO 2021; 2021
Institución organizadora:
Universidad Nacional de Misiones
Resumen:
Las plantas son el sistema más económico yseguro para la producción de pro- teínas farmacéuticas e industriales. Laproducción de proteínas recombinantes en la vía secretoria de la mayoría desistemas como células de mamíferos y levaduras está limitada por la capacidadde plegamiento y transporte, utilizándose diversas estrategias de ingenieríacelular para incrementar la capacidad de sintetizar pro- teínas que requierende un procesamiento típico de esta vía. En cambio, en células vegetales estetipo de estrategias no han sido exploradas. El objetivo de este trabajo fueevaluar el impacto de un factor de transcripción vinculado a la síntesis dereservas en semillas, LEC2, en la producción de proteínas foráneas en hojas. Lahipótesis planteada es que la expresión ectópica del mismo produciría cambiosen el desarrollo de la vía secretoria que aumentarían los niveles deacumulación de proteínas reporteras. Para evaluar esta hipótesis se emplearon genes reporteros dirigidos porel promotor CaMV35S y el factor de transcripción LEC2 como efector los cualesfueron introducidos en hojas de Nicotiana benthamiana mediante agroifiltracióny se compararon los resultados obtenidos con y sin efector. Cabe aclarar queLEC2 no es capaz de unirse al promotor CaMV35S y los posibles efectosobservados serían indirectos. Inicialmente se estudió el im- pacto de LEC2 enla localización de marcadores fluorescentes de la vía secretoria: GFP-HDEL(Retículo Endoplásmico, ER), ST- GFP (Golgi), GFP-BP80 (compartimientosprevacuolares, PVC) y RFP-AFVY (vacuola) mediante microscopia confocal debarrido laser (CLSM). No se observaron diferencias en los patrones defluorescencia de ER-GFP y ST-GFP, en cambio GFP-BP80 y RFP-AFVY son secretadosen presencia de LEC2, indicando una alteración post-Golgi del funcionamiento dela vía secretoria. Los niveles de acumulación se evaluaron por inmunoblot,observandosé incrementos de 2,5-3,5 veces en la acumulación de proteínasretenidas en el ER y de 3-6 veces para proteínas vacuolares en presencia delefector. La presencia fluorescencia correspondiente a GFP-BP80 en el apoplastollamó la atención debido a la inestabilidad de GFP a pH ácido. Por ello se estimóel pH del apoplasto in vivo mediante CLSM en plantas de Arabidopsis thalianaApo-pHusion que expresan de forma estable el sensor de pH mRFP1?EGFPdireccionado a apoplasto, observándose un aumento del pH en hojas infiltradascon LEC2 res- pecto a controles sin infiltrar o infiltrados con un vector vacíoa los 5 posinfiltración. Teniendo en cuenta que se ha informado que elapoplasto es un compartimiento proteolítico y que el uso de inhibidores deproteasas incrementa los rendimientos de proteínas foráneas secretadas sedecidió evaluar la actividad proteolítica. Empleando azocaseína como sustratose evaluó la actividad de extractos de hojas de N. benthamiana infiltradas conun vector vacío o LEC2, siendo los valores obtenidos de un 50% y 25%,respectivamente, respecto a extractos sin infiltrar. En conclusión, demostramosque la expresión de LEC2 incrementa significativamente entre 3 y  6 veces los niveles de acumulación dereporteros en la vía secretoria y disminuye la actividad proteolítica, siendouna estrategia novedosa potencialmente aplicable tanto en plataformas deproducción de proteínas transitorios como estables.