Efecto de LEC2 sobre la expresión de proteínas heterólogas en hojas de Nicotiana benthamiana

OCAMPO, CAROLINA GABRIELA; PETRUCCELLI SILVANA

Buenos Aires

Simposio; XIII Simposio REDBIO Argentina 2021; 2021

REDBIO

Las plantasson el sistema más económico y seguro para la producción de proteínas farmacéuticase industriales. Muchas de estas proteínas requieren de un procesamiento típicode la vía secretoria para alcanzar una conformación activa y soluble. En algunossistemas de expresión como células de mamífero y levaduras, lasíntesis de proteínas foráneas en la vía secretoria seencuentra limitada por la capacidad de plegamiento y transporte, utilizándoseestrategias de ingeniería celular para superar estas limitaciones e incrementarlos rendimientos de producción En cambio, en células vegetales este tipo deestrategias no han sido exploradas. El objetivo de este trabajo fue evaluar elimpacto del factor de transcripción LEC2, vinculado a la síntesis de reservasen semillas en la producción de proteínas foráneas en hojas. La hipótesisplanteada es que la expresión ectópica de este factor produciría cambios en eldesarrollo de la vía secretoria conduciendo a una mayor acumulación deproteínas reporteras. Para evaluar esta hipótesis de utilizaron diferentesgenes reporteros dirigidos por el promotor CaMV35S y el factor de transcripciónLEC2 como efector que fueron introducidos en hojas de Nicotiana benthamiana utilizando agrobacterias como método dedelivery, comprándose los resultados obtenidos con y sin efector. Cabe aclararque LEC2 no es capaz de unirse al promotor CaMV35S por lo que si seobservan efectos los mismos son indirectos. Inicialmente se estudió el impactode LEC2 en la localización de marcadores fluorescentes de la vía secretoria: GFP-HDEL (Retículo Endoplásmico, ER), ST-GFP (Golgi), GFP-BP80 (compartimientosprevacuolares, PVC) y RFP-AFVY (vacuola). No se observaron diferencias en lospatrones de fluorescencia de ER-GFP y ST-GFP, en cambio GFP-BP80 y RFP-AFVY sonsecretados en presencia de LEC2, lo que indica una alteración post-Golgi delfuncionamiento de la vía secretoria. Los análisis cuantitativos realizados porinmunoblot, mostraron que LEC2 produce incrementos 2,5‐3,5  veces en la acumulación de  proteínas retenidas en el ER y de 3‐6 vecespara proteínas vacuolares. La presencia fluorescencia correspondiente aGFP-BP80 en el apoplasto, llamó la atención ya que habitualmente GFP no esestable a pH ácido. Por este motivo se estudió el pH delapoplasto in vivo mediante CLSM enplantas de Arabidopsis thalianaApo-pHusion que expresan de forma estable el sensor de pH mRFP1?EGFPdireccionado a apoplasto, observándose un aumento del pH en hojas infiltradascon LEC2 respecto a controles sin infiltrar o infiltrados con un vector vacío alos 5 posinfiltración. Teniendo en cuenta que se ha informado que el apoplastoes un compartimiento proteolítico y que el uso de inhibidores de proteasasincrementa los rendimientos de proteínas foráneas dirigidas a estecompartimiento se decidió evaluar la actividad proteolítica. Empleando azocaseína como sustrato seevaluó la actividad de extractos de hojas de N. benthamiana infiltradascon un vector vacío o LEC2, obteniéndose valores de actividad del 50% y 25%,respectivamente, respecto a hojas sin infiltrar. En conclusión, demostramos quela expresión de LEC2 incrementa significativamente los niveles de acumulación dereporteros en la vía secretoria (3-6 veces) y disminuye la actividadproteolítica, siendo una estrategia novedosa potencialmente aplicable tantopara las plataformas de producción de proteínas que utilizan métodos deexpresión transitoria como estable.