Clonado y expresión de un anticuerpo monoclonal murino anti-transgluaminasa tisular humana

VECCHI, BRUNO; PETRUCCELLI, SILVANA

Rosario

Congreso; REDBIO 2009 VII Simposio Argentino y II Congreso Internacional de Biotecnología. 2009; 2009

REBIO-FAO

Transglutaminasa tisular humana (htTG), es un componente principal en la patogénesis y en el diagnóstico de la enfermedad celíaca . Los ensayos séricos, primera etapa en el diagnóstico de la enfermedad, requieren de disponibilidad tanto de htTG como de anticuerpos anti-tTG recombinantes. Es imperante, por ende, disponer de clones de estos anticuerpos para su posterior expresión heteróloga en altos niveles. Objetivos: Clonar y expresar la cadena liviana y los dominios variable y constante-1 de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal 2G3. Resultados: La RT-PCR fue exitosa tanto con primers hexaméricos al azar, como con primers reversos gen-específicos. La integridad del cDNA se confirmó mediante PCR utilizando primers de alfa-actina. La amplificación por PCR de ambas cadenas fue posible utilizando touchdown PCR y una mezcla de primers degenerados. La identidad de los fragmentos amplificados se confirmó por PCR utilizando primers internos a los dominios constantes para las cadenas κ y γ murinas. Los datos de secuencia fueron analizados utilizando la base de datos de inmunogenes IMGT; se confirmó la continuidad del marco de lectura y la ausencia de arreglos V-J y V-D-J no funcionales. Luego de subclonar ambos fragmentos en el vector de expresión periplásmica pComb3H, se ensayaron distintas temperaturas y tiempos de expresión. La presencia de Fab funcional se detectó induciendo a 28ºC durante 16 hs. en medio LB suplementado con glucosa, mediante inmunoblot con un anticuerpo anti-Fab.