Expresión estable de GFP fusionado a señales de direccionamiento a vacuolas de reserva en Nicotiana tabacum

LAREU, J. FABRICIO; PETRUCCELLI, SILVANA

Rosario

Congreso; REDBIO 2009 VII Simposio Nacional de Biotecnología y II Congreso Internacional de Biotecnología; 2009

REDBIO-FAO

En la actualidad las Plantas Transgénicas son el sistema potencialmente más económico utilizado como Biorreactor. No obstante el principal inconveniente  que presentan, es que los niveles de acumulación de proteínas recombinantes son bajos (<1% de la proteína soluble total), así como también es el escaso conocimiento del origen de estas vías y de las modificaciones post-transcripcionales. Una de las posibles estrategias para lograr un aumento en la expresión, es direccionar a órganos de reserva en semillas. En trabajos previos, fueron identificadas dos señales de direccionamiento presentes en  la región C-terminal de proteínas de reserva (KISIA y GNIFRGF) suficientes para dirigir a vacuola en una suspensión de protopastos de Arabidopsis thaliana, sin embargo este sistema sólo presenta un único tipo de vacuola. En este trabajo, estas dos señales de direccionamientos fueron estudiadas en un sistema de expresión estable. Para ello se obtuvieron plantas transgénicas de Nicotiana tabacum con las contrucciones de genes reporteros: green fluorescent protein- β-glucuronidase (GFP-GUS) fusionadas a cada una de las señales C-terminal. Las plantas obtenidas fueron analizadas por PCR con primers específicos sobre las señales de direccionamiento. De las mismas se obtuvieron 3 líneas independientes con la señal KISIA y 5 con la señal GNIFRGF. Además, para evitar posible silenciamiento post-transcripcional se co-expresó supresores de silenciamiento (HC-Pro / P2b). Por último, las plantas PCR positivas se analizaron: 1) mediante microscopía de fluorescencia observándose localización en vacuolas para ambas construcciones y, 2) cuantificación por espectrofluorometría obteniéndose niveles aceptables de acumulación con ambas construcciones