Optimización de un protocolo de expresión temporal en Lactuca sativa y su aplicación en la expresión de una proteína de interés en diagnóstico

VECCHI, BRUNO; PETRUCCELLI, SILVANA*,

Valparaiso

Congreso; VI Encuentro Latinoamericano y del Caribe de Biotecnología Agropecuaria. REDBIO-Chile 2007; 2007

REDBIO-CHILE

380Optimización de un protocolo de expresión temporal en Lactuca sativa y su aplicaciónen la expresión de una proteína de interés en diagnóstico.Bruno VecchiCIDCA, Argentinavecchi@cidca.org.arPetruccelli, Silvana CIDCA, Argentina.La expresión transitoria en vegetales es una alternativa atractiva a la generación de plantastransgénicas estables para análisis de funcionalidad génica, estudio de promotores yproducción de proteínas heterólogas de interés clínico o industrial. Si bien requiere menorinfraestructura y tiempo, cuando es llevada a cabo mediante Agrobacterium depende denumerosas variables que afectan la relación planta-patógeno. Más aún, el efecto de muchasvariables en los niveles de expresión es contradictorio en literatura, por lo cual lascondiciones deben ser empíricamente ajustadas para cada sistema particular. Los objetivosdel trabajo fueron desarrollar un protocolo de expresión temporal eficiente en lechuga(Lactuca sativa) mediante agroinfección en hoja y emplearlo para la expresión de unaproteína de diagnóstico, la transglutaminasa tisular humana (tTG). Para la optimización de laexpresión transiente se utilizó un diseño experimental factorial en el cual se le asignaron dosniveles arbitrarios para cada variable (variedad del cultivo vegetal, método de infiltración,densidad de inóculo, concentración de osmolito en el medio de infiltración y tiempo decosecha). La eficiencia en la expresión transitoria se determinó midiendo actividad -glucuronidasa del gen reportero GUS por espectrofluorometría. La expresión de tTG se llevóa cabo utilizando tres construcciones con señales de direccionamiento a citosol, RE yespacio extracelular; su presencia se determinó por ELISA indirecto utilizando un MoAb antitTG.La variable que mayor efecto tuvo fue el método de agroinfiltración; utilizando presiónpositiva los niveles fueron hasta 400% mayores que aplicando vacío, presumiblemente porun aumento en el área infiltrada por unidad de masa de tejido. La presencia de sacarosa a55g/L en el medio de infiltración y el aumento del tiempo de incubación tuvieron también unacontribución positiva en la expresión. El aumento de la densidad de inóculo desde 0,3 a 0,6D.O. tuvo una incidencia negativa en la actividad, produciendo mayor necrosis en el tejido.Utilizando este protocolo optimizado, se lograron aumentar en más de 20 veces los nivelesde expresión del reportero, y fue posible expresar tTG a valores superiores al control con lastres construcciones. Aquella con direccionamiento a RE fue la que presentó mayores nivelesde acumulación.Palabras claves: Expresión transitoria, optimización, lechuga, transglutaminasa.