INVESTIGADORES
PETRUCCELLI Silvana
congresos y reuniones científicas
Título:
Fusión de proteínas fluorescentes rojas a la cadena liviana del anticuerpo 14D9 y su expresión transitoria en hojas de N.benthamiana.
Autor/es:
GONZALEZ, CINTIA DANIELA; PETRUCCELLI, SILVANA
Lugar:
La Plata
Reunión:
Congreso; XXVIII Reunión Argentina de Fisiología Vegetal (RAFV 2010; 2010
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Fisiología Vegetal
Resumen:
La producción de proteínas recombinantes de estructura compleja en plantas, como es el caso de los anticuerpos, se encuentra limitada por sus bajos niveles de acumulación. Con la objetivo de generar herramientas que permitan estudiar más fácilmente el efecto de distintos factores (por ejemplo: supresores de silenciamiento, moduladores de la capacidad plegamiento y secreción de la célula) se desarrolló un sistema reportero que consiste en una inmunoglobulina fusionada a proteínas fluorescentes (PF). Con esta finalidad, en este trabajo, la cadena liviana del anticuerpo 14D9 fue fusionada a PFs rojas, estables a pH acídicos de manera de poder evaluar la acumulación en apoplasto. Para obtener la construcción de interés, se diseño una estrategia utilizando OE-PCR (overlap extension PCR) para fusionar los genes codificantes para las proteínas fluorescentes roja Cherry (monomérica) y tDTomato (dimérica) al extremo C-Terminal de la cadena liviana del anticuerpo monoclonal 14D9. Por dos PCR consecutivos se obtuvieron sec-Kappa-Cherry y sec-Kappa-TdT (versiones secretorias) que fueron clonadas en pENTR-TEV-TOPO (Invitrogen) y subclonadas por recombinación empleando clonasas LR en pGWB2 vector binario que posee el promotor CaMV35S. El plásmido resultante fue introducido en agrobacterium GV3101 por electroporación. Hojas de Nicotiana benthamiana fueron infiltradas con la agrobacteria llevando tanto sec-Kappa-Cherry como sec-Kappa-TdT evaluándose la fluorescencia microscopía de fluorescencia a distintos tiempos post-infiltración, confirmándose la funcionalidad de la construcción y acumulación de las fusiones principalmente en el apoplasto, lo que permite concluir que aún en ausencia de la cadena pesada, la cadena kappa es secretada.
