ET-Estudios de biosimilaridad de Anticuerpo monoclonal

MORENO DE COLONNA, SILVIA; VALACCO, MARÍA PÍA; NEME TAUIL, RICARDO MARTÍN; FERNÁNDEZ, JORGE GERMÁN; COUTO, ALICIA; PAROLA, ALEJANDRO

2017-01-01

2017-12-01

Tecnologia sanitaria y curativa-Varios

La empresa interesada nos provee del producto biosimilar que se desea validar y el innovador.Se realiza la caracterización de la proteína en cuanto a su masa molecular, secuencia aminoacídica, puentes disulfuro y modificaciones postraduccionales. Para la determinación de masa molecular de la proteína intacta se utilizó el espectrómetro MALDI TOF TOF (Bruker). Para el mapeo peptídico se comenzó con digestiones virtuales para determinar las enzimas que permitan detectar zonas complementarias de la secuencia, y asegurarnos de cubrir extremos N y C terminales. A partir de esto se decidió realizar digestiones con varias proteasas de corte específico (Tripsina, Quimotripsina, Gluc-c y AspN) y análisis de los fragmentos proteolíticos por MS y MSMS por MALDI TOF y con nanoHPLC acoplada a QExactive para lograr cobertura total de la secuencia con los péptidos identificados. Se logró una cobertura de un 90%. Para lograr un 100% se decidió trabajar sobre la proteína deglicosilada, para detectar la masa sin modificar de péptidos que se glicosilan. Se trató a la muestra con PNGasa, sialidasa y O-glicanasa y luego se digirió con las enzimas mencionadas arriba y con combinaciones en serie de ellas (Trips + Quimotrips, Gluc+ AspN). De esta forma se logró un 100% de cobertura.Se realizaron digestiones de la molécula glicosilada con las mismas enzimas, seguida de un enriquecimiento en glicopéptidos con microcolumnas HILIC para luego identificar sitios de glicosilación y poder identificar la composición de los glicanos.Se pudo finalizar la construcción de la base de datos de glicanos, para poder realizar su búsqueda automática con el software Proteome Discoverer. Se identificaron sitios de glicosilación que pudieron verificarse con métodos manuales que pudimos poner a punto. Todavía quedan algunos sitios por identificarse pero ya se tenemos puesto a punto el flujo de trabajo.Se elaboraron los informes según requisitos de las empresas, para ser presentados ante entidades regulatorias.