PERSONAL DE APOYO
NEME TAUIL Ricardo Martin
convenios, asesorías y/o servicios tecnológicos
Título:
Estudios de biosimilaridad de Anticuerpo monoclonal
Autor/es:
MORENO DE COLONNA, SILVIA; VALACCO, MARÍA PÍA; NEME TAUIL, RICARDO MARTÍN; PAROLA, ALEJANDRO; FERNÁNDEZ, JORGE GERMÁN; COUTO, ALICIA
Fecha inicio:
2016-01-01
Fecha finalización:
2016-12-01
Campo de Aplicación:
Tecnologia sanitaria y curativa-Varios
Descripción:
Para la determinación de masa molecular de la proteína intacta se utilizó el espectrómetro de Masa MALDI TOF TOF (Bruker).Para el mapeo peptídico, que pretende cubrir la mayor parte de la secuencia por MS y MSMS, se comenzó realizando digestiones virtuales para determinar enzima óptima para obtener la mayor cobertura posible, usando enzimas que permitan detectar zonas complementarias de la secuencia, y para asegurarnos de cubrir extremos N y C terminales. A partir de este análisis se decidió realizar digestiones enzimáticas de la molécula con varias proteasas de sitio de corte específico (Tripsina, corta a la derecha de lisina y argininas; Quimotripsina, corta a la derecha de triptofano, metionina, fenilalanina, tirosina, leucina; Gluc-c, corta a la derecha de glutámico) y análisis de los fragmentos proteolíticos por MS y MSMS por MALDI TOF y con nanoHPLC, acoplada a Q Exactive para lograr cobertura total de la secuencia con los péptidos identificadosSe logró una cobertura de aproximadamente un 100% por MS y 95% por MSMS.También se realizaron digestiones con las mismas enzimas, de la molécula glicosilada, para luego identificar sitios de glicosilación y poder identificar la composición de los diferentes glicanos. Se pudo finalizar la construcción de la base de datos de glicanos, para poder realizar la búsqueda automática de los mismos, con el software ProteomeDiscoverer. Se identificaron sitios de glicosilación, que además pudieron ser verificados con métodos manuales que pudimos poner a punto. Todavía quedan algunos sitios por identificarse, pero ya se tenemos puesto a punto el flujo de trabajo.También se pudo avanzar en la puesta a punto del estudio de los puentes disulfuro con el método de cianilación.Se elaboraron los informes según requisitos de las empresas, para ser presentados ante entidades regulatorias.
