ANALISIS ESTRUCTURAL DE COMPLEJOS PROTEICOS POR ESPECTROMETRIA DE MASA MALDI-TOF.TOF

NEME TAUIL, RICARDO*; GONZÁLEZ BARDECI, NICOLÁS; VALACCO, M.PIA; MORENO, SILVIA

Los Cocos, Cordoba

Congreso; II Congreso Argentino de Espectrometría de Masa; 2014

Sociedad Argentina de Espectrometría de Masa

La espectrometría de masa por la técnica de MALDI-TOF-TOF (Matrix-Assisted-Laser-Desorption-Ionization) es sumamente adecuada para el análisis de proteínas purificadas y por lo tanto una herramienta sumamente útil para el estudio de propiedades estructurales de un complejo proteico. Una de las preguntas que uno se puede plantear y abordar con esta técnica es el estudio estructural de las interacciones intermoleculares que puede tener una proteína con otra proteína homóloga o heteróloga. La estrategia general a utilizar para estos estudios es la siguiente. Se debe contar con la o las proteínas purificadas. Se someten luego la o las proteinas a una reacción de entrecruzamiento utilizando reactivos bifuncionales que a través de la interacción covalente con dos partes espacialmente próximas de dos moléculas homólogas o heterólogas, las mantenga covalentemente unidas. La distancia a la cual pueden estar los polipéptidos a ser ligados por el reactivo bifuncional (en general reactivos para grupos amino) está dada por la distancia de los dos grupos funcionales del reactivo (en general unos 10 Å). Las reacciones de entrecruzamiento son poco eficientes, de modo que para estudiar el producto resultante hay que separarlo de la o las proteinas interactuantes por SDS-PAGE, teñir el gel con Coomassie coloidal, y cortar la banda cuyo tamaño sugiera que hubo unión covalente. Esa banda es digerida con tripsina u otra proteasa específica de sitio de corte; los péptidos eluídos del gel, y analizados por MALDI-TOF-TOF. El perfil de masas trípticas se compara con el perfil tríptico de los reactantes sin unir covalentemente. Del análisis y fragmentación (MS/MS) de los péptidos que desaparezcan en los reactantes y de los que aparezcan en el producto entrecruzado se pueden deducir sitios de interacción entre dos o más moléculas. Se ejemplifica la estrategia con un trabajo de nuestro grupo del estudio de la dimerización del extremo amino-terminal de Bcy1, la subunidad regulatoria de la proteína quinasa A de Saccharomyces cerevisiae. El extremo amino terminal de las subunidades regulatorias de PKA de mamiferos ha sido cristalizado pero nada se conoce sobre la Bcy1. Se purificó la proteína Bcy1 sobreexpresada en la misma levadura. La proteína purificada se sometió a entrecruzamiento en solución con cantidades crecientes del reactivo bifuncional EGS (ethylene glycolbis (succinimidylsuccinate)), clivable por hidroxilamina y con un brazo espaciador de 16 Å. El producto de la reacción fue analizado por SDS-PAGE, revelado por tinción con Coomassie coloidal. Las bandas correspondientes al producto monomérico y al producto, que de acuerdo a la masa aparente podria corresponder al dímero, fueron cortadas, tratadas con tripsina, y los péptidos trípticos eluídos fueron analizados por MALDI TOF. Los espectros de las especies sin y con entrecruzamiento fueron comparados, y se hizo evidente la falta completa de un péptido en la banda de gel tratada con EGS. La identidad del péptido fue identificada por MS/MS. Los resultados obtenidos fueron analizados interpretándolos sobre la estructura cristalizada del amino terminal de la subunidad R de mamíferos, obteniéndose prediccines sobre la posible estructura tridimensional del amino terminal de Bcy1.