INVESTIGADORES
VALACCO Maria Pia
congresos y reuniones científicas
Título:
ANALISIS ESTRUCTURAL DE COMPLEJOS PROTEICOS POR ESPECTROMETRIA DE MASA MALDI-TOF.TOF
Autor/es:
NEME TAUIL, RICARDO MARTIN; NICOLAS GONZALEZ BARDECI; MARIA PIA VALACCO; SILVIA MORENO DE COLONNA
Lugar:
Los cocos
Reunión:
Congreso; II Congreso de la Sociedad Argentina de Espectrometría de masa; 2014
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Espectrometría de masa
Resumen:
La espectrometría de masa por la técnica de MALDI-TOF-TOF (MatrixAssisted-Laser-Desorption-Ionization)es sumamente adecuada para elanálisis de proteínas purificadas y por lo tanto una herramienta sumamenteútil para el estudio de propiedades estructurales de un complejo proteico.Una de las preguntas que uno se puede plantear y abordar con esta técnicaes el estudio estructural de las interacciones intermoleculares que puedetener una proteína con otra proteína homóloga o heteróloga. La estrategiageneral a utilizar para estos estudios es la siguiente. Se debe contar con lao las proteínas purificadas. Se someten luego la o las proteinas a unareacción de entrecruzamiento utilizando reactivos bifuncionales que a travésde la interacción covalente con dos partes espacialmente próximas de dosmoléculas homólogas o heterólogas, las mantenga covalentemente unidas.La distancia a la cual pueden estar los polipéptidos a ser ligados por elreactivo bifuncional (en general reactivos para grupos amino) está dada porla distancia de los dos grupos funcionales del reactivo (en general unos 10Å). Las reacciones de entrecruzamiento son poco eficientes, de modo quepara estudiar el producto resultante hay que separarlo de la o las proteinasinteractuantes por SDS-PAGE, teñir el gel con Coomassie coloidal, y cortarla banda cuyo tamaño sugiera que hubo unión covalente. Esa banda esdigerida con tripsina u otra proteasa específica de sitio de corte; los péptidoseluídos del gel, y analizados por MALDI-TOF-TOF. El perfil de masastrípticas se compara con el perfil tríptico de los reactantes sin unircovalentemente. Del análisis y fragmentación (MS/MS) de los péptidos quedesaparezcan en los reactantes y de los que aparezcan en el productoentrecruzado se pueden deducir sitios de interacción entre dos o másmoléculas.Se ejemplifica la estrategia con un trabajo de nuestro grupo del estudio de ladimerización del extremo amino-terminal de Bcy1, la subunidad regulatoriade la proteína quinasa A de Saccharomyces cerevisiae. El extremo aminoterminal de las subunidades regulatorias de PKA de mamiferos ha sidocristalizado pero nada se conoce sobre la Bcy1. Se purificó la proteína Bcy1sobreexpresada en la misma levadura. La proteína purificada se sometió aentrecruzamiento en solución con cantidades crecientes del reactivobifuncional EGS (ethylene glycolbis (succinimidylsuccinate)), clivable porhidroxilamina y con un brazo espaciador de 16 Å. El producto de la reacciónfue analizado por SDS-PAGE, revelado por tinción con Coomassie coloidal.Las bandas correspondientes al producto monomérico y al producto, que deacuerdo a la masa aparente podria corresponder al dímero, fueron cortadas, tratadas con tripsina, y los péptidos trípticos eluídos fueron analizados porMALDI TOF. Los espectros de las especies sin y con entrecruzamientofueron comparados, y se hizo evidente la falta completa de un péptido en labanda de gel tratada con EGS. La identidad del péptido fue identificada porMS/MS. Los resultados obtenidos fueron analizados interpretándolos sobrela estructura cristalizada del amino terminal de la subunidad R demamíferos, obteniéndose prediccines sobre la posible estructuratridimensional del amino terminal de Bcy1.